本发明专利技术公开了一种检测乐果的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。所述检测乐果的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、乐果标准品、乐果的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测乐果的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明专利技术检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测乐果的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。
技术介绍
乐果是内吸性有机磷杀虫、杀螨剂。杀虫范围广，对害虫和螨类有强烈的触杀和一定的胃毒作用。在昆虫体内能氧化成活性更高的氧乐果，其作用机制是抑制昆虫体内的乙酰胆碱脂酶，阻碍神经传导而导致死亡，具有致癌性、致突变型和致畸性，因此安全问题受到高度重视。乐果残留分析一般使用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)及气相色谱质谱联用技术(GC/MS)，这些方法灵敏、准确，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高，而且需专业人员操作，很难满足对样品进行现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对乐果检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种蔬菜水果中乐果残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。本专利技术的目的之二在于提供一种快速简便地检测蔬菜水果中乐果的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测蔬菜水果中乐果残留量。本专利技术目的之一是这样实现的:检测乐果的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、乐果标准品溶液、抗乐果的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。本专利技术目的之二是这样实现的:检测乐果的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于: (1)免疫原的制备:将半抗原乐果与牛血清白蛋白(BSA)偶联，得到免疫原(乐果-BSA)； (2)包被原的制备:将半抗原乐果与卵血清白蛋白(OVA)偶联，得到包被原(乐果-OVA)； (3)单克隆抗体的制备: a.用步骤(I)的免疫原(乐果-BSA)免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗乐果的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；b.以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗乐果的单克隆抗体IgG ； c.用步骤(2)的包被原包被96孔包被板； (4)样品的前处理及检测: 取包被有包被原(乐果-OVA)的多孔包被板，加入50 μ?的乐果到各自的微孔中，加50μ?以缓冲液稀释的抗乐果抗体，250C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗体，25°C?37°C振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200 μ?增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的乐果含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作为固相载体。本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测乐果。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面:第一，特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗乐果的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化,获得抗乐果的单克隆抗体IgG。第二, Eu3+标记抗体的制备。本专利技术测定方法:测定的基础是标记免疫反应。包被有乐果-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗乐果抗体，振荡反应，游离的乐果与微孔板上的乐果-OVA竞争抗乐果抗体，洗涤液洗涤，没有连接的乐果抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外灯的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中乐果的量。本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。【附图说明】图1为本专利技术的乐果标准品与抗体的TR-FIA标准抑制曲线图。【具体实施方式】实施例1、免疫原与包被原制备 本专利技术免疫原(乐果-BSA)的合成:准确称取乐果324mg溶解在2mL N, N- 二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3小时，调节反应液pH 10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理盐水)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg, N, N- 二环己基碳二亚胺(DCC) 45.4mg，4°C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3天，每6小时更换透析液，将所得产物低压冻干，于_20°C保存备用； 包被原(乐果-0VA)的合成:在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶联物乐果-0VA，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。2、单克隆抗体制备 2.1动物免疫 用步骤I制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μδ/0.2mL。首次免疫，用无菌0.0lmol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(乐果-BSA)，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，劲背部皮下分2?3点注射；加强免疫，用0.0lmol/L pH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14?21天，第3次免疫后7?10天开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清,用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3?4天，腹腔注射乐果-BSA抗原100μδ/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。2.2单克隆抗体制备 分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，换一套镊子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪开一小口。换一套镊子和剪刀，用剪刀剪开腹膜，露出脾脏，再换一套器械用镊子夹住脾脏，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPM1-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基(RPM1-1640)，静置2min，将上层细胞液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作I次。1200r/min离心lOmin，除去上清。将18个免疫脾细胞与I?2X107个SP2/0骨髓瘤细胞按照1:10或1:5的比例加入离心管中，进行混匀，然后于1500r/min水平离心lOmin，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37°C水浴锅中。在Imin内缓慢将50% PEG 0.8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30s后，静置lmin，然后慢慢加入事先进行37°C预温的40mL基础培养基(RPM1-1640)ο加基础培养基方法为:第Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测乐果的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，乐果标准品，乐果的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，刘静，张淑雅，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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