本发明专利技术公开一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。溶栓液的各组分及浓度为：尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L；灌注液I的各组分及浓度为：EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L；灌注液II的各组分及浓度为：十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L；灌注液III的组分及浓度为：DNase I0.01g/L；灌注液IV的组分及浓度为：过氧乙酸0.01%。溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV依次对肝脏进行灌注，可制备去细胞肝脏支架，此方法去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白等成分。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝脏组织工程领域，特别是涉及一种。
技术介绍
在现有肝脏替代疗法还存在不足的背景下，研制可供移植的组织工程肝脏十分必要。肝脏组织工程是构建可移植肝脏的一条创新型途径，其核心内容是通过将肝脏种子细胞与生物支架材料相复合，构建出可移植的组织工程肝脏，用于对病损肝脏进行形态、结构及功能的永久性替代。目前，由于缺乏合适的支架材料，通常所构建的组织工程肝脏结构简单，缺乏完善的血管网络而不能达到肝脏替代的目的。理想的肝脏支架材料的性能和结构要求包括:1、支架材料具有可生物降解性和生物相容性，降解产物不应有毒和引起炎症；2、支架材料具有可加工性及孔隙大小、孔隙率的可调控性，为预血管化和血管生成创造条件；3、支架材料应有足够的表面积用于细胞粘附，也应有足够的空间使细胞集落、扩展及增殖。目前常用支架材料主要包括两类，一类是天然基质材料，如:胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸、海藻酸钠和壳聚糖等，它们均有较好的生物相容性，可为细胞组织化生长提供微环境，但由于缺乏组织与器官构建中所需的血管床样结构，且其形成的支架材料很难有较好的稳定性和机械性能，缺乏可加工性，导致天然基质材料在应用中存在一定的障碍。另一类是合成高分子聚合物，如:聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，具有生物降解性好，力学性能良好，降解速度可控等优点，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。目前肝脏组织工程中常用的支架材料是上述支架材料通过复合、修饰和改性等方法改造而来的材料，可为种植于其上的细胞提供更合适的环境因素，生长因子，及诱导新生血管形成的预血管化位点和多孔结构等。然而，由各种天然细胞外基质构成的复杂三维网状支架，相对于肝细胞生长所需的复杂的肝脏结构来说，目前肝脏组织工程中常用的支架材料显得过于简单，不能很好地解决肝细胞生长所需要的营养输送和废物排出等问题。去细胞支架材料作为一种天然的生物支架，相对于目前肝脏组织工程中常用的支架材料，不仅保留细胞粘附、增殖所依赖的细胞外基质成分，如:胶原蛋白及纤维粘连蛋白等，更重要的是保留细胞高密度生长所需要的管道结构，是最适合肝细胞生长的支架材料。但是，目前关于去细胞肝脏支架的制备方法还不完善，制备效果不够理想。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种，去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白和糖蛋白等成分。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是:提供一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，试剂盒包括溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV。其中，溶栓液的各组分及浓度为:尿激酶100000IU/L、NaCL9g/L。灌注液I的各组分及浓度为:EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L。灌注液II的各组分及浓度为:十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L。灌注液III的组分及浓度为:DNase I 0.01g/L。灌注液IV的组分及体积浓度为:过氧乙酸0.01%。其中，溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是:提供一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒的使用方法，包括以下步骤:第一次灌注:通过经结扎肝动脉、胆管和去除胆囊处理的肝脏的门静脉灌注500ml含100000IU/L尿激酶的生理盐水溶液，灌注完成后，肝脏于_80°C存放48h以上。本专利技术灌注的肝脏为一叶或全肝。灌注前还需去除肝脏上的膈肌组织和多余的脂肪组织等。第二次灌注:通过肝脏门静脉灌注3000ml含0.2g/L EDTA的生理盐水溶液。第三次灌注:通过肝脏门静脉灌注15L含5g/L十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液。第四次灌注:通过肝脏门静脉灌注200ml0.01g/L的DNase I溶液，灌注完成后，于4°C存放2h。第五次灌注:通过肝脏门静脉灌注200ml体积浓度为0.01%的过氧乙酸溶液，灌注完成后，于4 C保存3h。其中，0.01%的过氧乙酸溶液也可为含0.01%过氧乙酸的生理盐水溶液。第六次灌注:通过肝脏门静脉灌注IOL含1%青-链霉素的生理盐水溶液，用时8h的灌注用于对肝脏进行冲洗，冲洗完成后，获得去细胞肝脏支架。其中，第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注均利用插入所述肝脏门静脉的硅胶管进行灌注。其中，灌注的肝脏为猪肝或尸肝等大动物的肝脏。其中，第一次灌注的速度为10ml/min。其中，第二次灌注的速度为35_50ml/min。其中，第三次灌注的速度为15_25ml/min。其中，第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注的灌注液其溶剂均为去离子水。本专利技术的有益效果是:区别于现有技术的情况，本专利技术的试剂盒包括溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV。其中，溶栓液的各组分及浓度为:尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L ;灌注液 I 的各组分及浓度为:EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L ;灌注液 II的各组分及浓度为:十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L ;灌注液III的组分及浓度为=DNaseI0.01g/L;灌注液IV的组分及体积浓度为:过氧乙酸0.01%。利用本专利技术的试剂盒可进行去细胞肝脏支架的制备，具体为溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV依次对肝脏进行灌注，灌注完成后获得的去细胞肝脏支架，去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白和糖蛋白等成分。【附图说明】图1是本专利技术制备的去细胞肝脏支架的结构图；图2是本专利技术制备的去细胞肝脏支架在DR机下门静脉造影的结构图一；图3是本专利技术制备的去细胞肝脏支架在DR机下门静脉造影的结构图二 ；图4是本专利技术制备的去细胞肝脏支架石蜡切片的苏木精-伊红染色结构图；图5是本专利技术制备的去细胞肝脏支架切片的Masson染色结构图；图6是本专利技术制备的去细胞肝脏支架切片的PAS染色结构图；图7是本专利技术制备的去细胞肝脏支架切片的银染结构图；图8是本专利技术制备的去细胞肝脏支架切片的电子显微镜扫描图。【具体实施方式】下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1猪肝与人肝体型相当，且易获得，是最适合构建组织工程肝脏的支架材料。下面以猪肝为例，详细介绍。本实施例的试剂盒包括:溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV。其中，溶栓液的各组分及浓度为:尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L。灌注液I的各组分及浓度为`:EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L。灌注液II的各组分及浓度为:十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L。灌注液III的组分及浓度为:DNase I 0.01g/L。灌注液IV的组分及体积浓度为:过氧乙酸0.01%。在本实施例中，溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。利用本实施例的试剂盒制备去细胞肝脏支架的方法如下:A.去细胞前肝脏的处理离体约8小时以内的新鲜家猪肝脏，取一叶肝组织，重500g，去除肝脏上附着的膈肌和脂肪等组织，结扎肝动脉和胆管等管道结构，仔细分离、去除胆囊。肝脏初步处理完成后，经肝脏门静脉插入19号硅胶管，连接蠕动泵，以用于试剂盒中溶液的灌注。B.首先本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV； 所述溶栓液的各组分及浓度为： 尿激酶 100000IU/L NaCL 9g/L 所述灌注液I的各组分及浓度为： EDTA 0.2g/L NaCL 9g/L 所述灌注液II的各组分及浓度为： 十二烷基硫酸钠 5g/L NaCL 9g/L 所述灌注液III的组分及浓度为： DNase I 0.01g/L 所述灌注液IV的组分及体积浓度为： 过氧乙酸 0.01%。
【技术特征摘要】
1.一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV ； 所述溶栓液的各组分及浓度为: 尿激酶100000IU/L NaCL9g/L 所述灌注液I的各组分及浓度为: EDTA0.2g/L NaCL9g/L 所述灌注液II的各组分及浓度为: 十二烷基硫酸纳5g/L NaCL9g/L 所述灌注液III的组分及浓度为: DNase I0.01g/L 所述灌注液IV的组分及体积浓度为: 过氧乙酸0.01%。`2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述溶栓液、灌注液1、灌注液I1、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。3.一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一次灌注:通过经结扎肝动脉、胆管和去除胆囊处理的肝脏的门静脉灌注500ml含100000IU/L尿激酶的生理盐水溶液，灌注完成后，所述肝脏于_80°C存放48h以上； 第二次灌注:通过所述肝脏门静脉灌注3000ml含0.2g/L EDTA的生理盐水溶液； 第三次灌注:通过所述肝脏门静脉灌注15L含5g/L十二烷基硫...
【专利技术属性】
技术研发人员：程远，潘明新，汪艳，李阳，高毅，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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