本发明专利技术提供了检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合CHO细胞基因组DNA上SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示区段。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分大肠杆菌或人类，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域。具体地说，本专利技术涉及CHO细胞DNA的检测方法。
技术介绍
在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。从1984年开始，国际官方机构陆续推出了针对生物制品残余DNA检测的各种限度标准，并且根据研究及 应用的不断变化而逐步修改完善。1997年，WHO第46届生物制品标准化专家委员会(ECBS)会议上，与会专家通过对传代细胞系残余DNA风险的再评估，认为残余DNA虽然不是主要危险因素，但应视为细胞污染物，要求清除至最低水平。根据这一再评估，建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的DNA含量为10ng。任何生物制品的纯化工艺应经验证，证明其去除细胞DNA的能力，包括参入示踪剂研究。另外，产品批次间的均一性应通过临床效果观察，以及三批以上的检测结果予以证实。目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系，如CHO、BHK、SP2/0、C127等，均有逆转录病毒颗粒阳性的报道。因此，对其残余DNA含量就需要严格控制。目前，针对不同的生物制品，其相对应的检测限也略有不同。一般而言，FDA规定医药生物制品中DNA污染的检测限为IOOpg/剂，WHO和EU略为宽松，检测限可达IOng/剂。低浓度的检测限对检测的手段及技术提出了更高的要求。关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在IOpg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。在目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系中，CHO细胞，S卩，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)因具有无限增殖性，可以传代百代以上，而成为目前生物工程上广泛使用的细胞。当今批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产，其余所有产品均是由CHO细胞和大肠杆菌生产。与原核的大肠杆菌相比，CHO属于真核哺乳细胞，能形成有活性的二聚体和糖基化的功能，因此，CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主，其已广泛用于重组蛋白药物的制取，是一种重要的工程表达细胞株。综上所述，本领域急需检测生物制品中残余CHO细胞DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法在第一方面，本专利技术提供一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第64-92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的第125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78-84bp。在优选的实施方式中，所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDN0:1所示区段的第67-92位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段的第125-144位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为29_20bp ;优选26和20bpo在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58_60°C，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值< 2°C。在另一优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID N0:3所示，所述反向引物如SEQ ID NO:4 所示。在第二方面，本专利技术提供一种检测体系，所述检测体系包含本专利技术第一方面所述的引物对。在优选的实施方式中，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO: 2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDN0:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。在优选的实施方式中， 所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDN0:2所示区段的第1-19位，所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDN0:2所示区段的第89-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为llObp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16_24bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58_60°C，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值< 2°C。在优选的实施方式中，所述第二引物对中所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID N0:6所示。在另一优选的实施方式中，所述检测体系还包含探针。在优选的实施方式中，所述探针是5-FAM-TITCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3和 / 或 5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3。在优选的实施方式中，所述检测体系的检测灵敏度为106-lfg/iU，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为0.lfg/u1.在第三方面，本专利技术提供一种CHO细胞基因组DNA的检测方法，所述方法包括:利用本专利技术第一方面所述的引物对或本专利技术第二方面所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在第四方面，本专利技术提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ?IDNO:1所示区段的第64?92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID?NO:1所示区段的第125?147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78?84bp。
【技术特征摘要】
1.一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述弓I物对包括正向弓I物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ IDNO:1所示区段的第64-92位；其中的反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段的第125-147位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为78-84bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQID N0:3所示，所述反向引物如SEQ ID N0:4所示。3.—种检测体系，其特征在于，所述检测体系包含权利要求1或2所述的引物对。4.如权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向弓I物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQID N0:2所示区段的第1-22位；所述反向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段的第86-110位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-110bp。5.如权利要求3或4所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含探针。6.如权利要求3-5中任一项所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系的检测灵敏度为IO6-1 fg/Ul，优选地，所述检测体系的检测灵敏度为0.1 fg/yl。7.一种CHO细胞基因组DNA的检测方法，所述方法包括:利用权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。8.—种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对。9.如权利要求8所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于CHO细胞基因组DNA上SEQ ID NO:2所示区段...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙玮洁，杨志行，吴婉欣，文明，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心，
类型：发明
国别省市：
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