本发明专利技术公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记（SEQ.ID.No.1）和由该标记转化得到的SCAR标记（SEQ.ID.No.2）以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。本发明专利技术的分子标记具有尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株特异性、一致性和稳定性并能够区分该专化型菌株与其它专化型致病菌差异，可以鉴别出尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原物，在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株的鉴定中具有重要作用，为建立尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原菌的特异、快速、高灵敏度、稳定可靠的分子检测技术体系奠定了基础。应用本发明专利技术可克服常规鉴定、鉴别尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌工作量大、周期长的缺点，实现了病原物的快速、准确鉴定和检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术 属于分子标记
，尤其涉及尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记及其应用，具体是尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记和由该标记转化得到的SCAR标记以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。
技术介绍
由尖抱键刀菌苦瓜专化型(Fusariumoxysporum Schl. f. sp. Momordicae Sun &Huang, F0M)引起的苦瓜枯萎病是一种危害严重的真菌性病害，该病害已遍及亚洲苦瓜主产区如菲律宾、日本、印度等国家，在我国广西、广东、湖南、福建、浙江、江西和台湾等省(区)发生严重，造成苦瓜产量的巨大损失。尖孢镰刀菌苦瓜专化型与引起葫芦科瓜类作物枯萎病的其他6个已知尖孢镰刀菌专化型病原菌在表型上非常接近而难以辨别，主要依赖于对特殊寄主的致病性或较窄的寄主范围来区分和鉴定，这一传统接种鉴定方法周期较长，耗时费力。分子标记技术已被广泛用于植物病原真菌种内、种间和属间亲缘关系的研究，为鉴定和检测病原菌提供了基础。利用随机扩增多态性DNA (RandomAmplifiedPolymorphic DNA, RAPD)指纹图谱丰富的信息量，寻找专一性DNA序列标签(SequenceTagged Sites, STS)制作特异探针或转换成更加稳定的序列特异扩增区域标记(SequenceCharacterized Amplified Region, SCAR),可以简化传统的鉴定技术,被成功地应用在多种植物病原真菌的病原鉴定和诊断中，如香蕉枯萎病生理小种、尖孢镰刀菌菠菜专化型、黄瓜专化型和丝瓜专化型等(廖林凤等，2009; Jiang, 2006; Wang等，2001; Bart等，2007)。这充分说明了利用分子标记技术将有可能成为鉴别和检测葫芦科瓜类作物枯萎病致病菌的尖孢镰刀菌各专化型的有力武器。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供特异专一的尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记RAPD标记和SCAR标记及其在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58_519,具有序列表SEQ.1D. No.1的喊基序列。上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58_519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_519，具有序列表SEQ.1D. No. 2的碱基序列。扩增SCAS58_519标记的引物对具有序列表SEQ.1D. No. 3和SEQ.1D. No. 4的碱基序列。上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记30八358_519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，PCR反应体系中含有序列表SEQ.1D. No. 3和SEQ.1D. No. 4的喊基序列的引物对Primerl和Primer2。该检测方法PCR反应的反应体系和扩增程序分别为反应体系共25 U L :12. 5 U L2XEs Taq MasterMix,内含 2XEs Taq PCR Buffer>3mM MgCl2, Es Taq Polymerase 和 400 u M dNTP Mix ;1. 0 u L 浓度 10 u mol .L-1 的 Primerl,l.OuL 浓度 10 u mol L-1 的 Primer2 ；2. Ou L 浓度 15ng/ u L 的模板 DNA, 8. 5 u LddH2O ；扩增程序94°C预变性5min ;94°C变性 lmin，58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30个循环；72°C延伸10min，4°C保存备用。专利技术人在开展苦瓜枯萎病菌的鉴定及其RAPD遗传多样性分析研究的基础上，成功获得了具有尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株特异性、一致性和稳定性并能够区分该专化型菌株与其它专化型致病菌差异的RAPD标记S58-519和SCAR标记SCAS58_519，该标记可以鉴别出尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原物，在尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株的鉴定中具有重要作用，为建立尖孢镰刀菌苦瓜专化型病原菌的特异、快速、高灵敏度、稳定可靠的分子检测技术体系奠定了基础。应用本专利技术可克服常规鉴定、鉴别尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌工作量大、周期长的缺点，实现了病原物的快速、准确鉴定和检测。附图说明图1是本专利技术的随机引物S58对24个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株的RAPD-PCR扩增图谱;其中，M DNA Ladder ；1~24 :表I中的1-24号菌株；CK :空白对照；图中箭头指示条带是S58_519。图2是本专利技术的SCAS58_519标记对48个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株的SCAR-PCR扩增图谱；其中，M DNA ladder ;1_11和2548 :尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株；12-14 :表2中1-3号菌株；1 5-16 :表I中1-2号菌株；17_18 :表2中34号菌株；19_20 :表I中6-7号菌株；21 :表I中5号菌株；22-24 :表I中8_10号菌株；CK :空白对照；图中箭头指示条带是SCAS58_519条带。图3是SCAS58_519标记对人工接种15d后苦瓜幼苗植株的不同部位组织总DNA的检测扩增图谱；其中，M DNA ladder ；1-10 :分别为接种幼苗的根部，根茎基部，子叶下部茎组织，子叶茎节部，子叶节上部茎，真叶节部，真叶叶柄，真叶，上部茎，上部叶；CK :空白对照。图4是SCAS58_519标记对苦瓜田间枯萎病发病植株的不同部位组织总DNA的检测扩增图谱；其中，M DNA ladder ;1_12 :分别为植株根部，根茎基部，子叶下部茎组织，子叶茎节部，子叶节上部茎，真叶节部，真叶叶柄，真叶，植株中部茎，植株中部叶，上部茎，上部Rf ；CK :空白对照。图5是SCAS58_519标记对采集自不同地区的苦瓜枯萎病发病植株的根系组织总DNA的检测扩增图谱；其中，M DNA ladder ;1_8 :样品来源地是广东清远市；9_16 :样品来源地是广东湛江市；17-24 :样品来源地是湖南衡阳市；25-30 :样品来源地是广西南宁市五塘镇；31-48 :样品来源地是广西农科院蔬菜所试验基地；CK :空白对照。具体实施方式专利技术人通过开展不同葫芦科枯萎病菌专化型菌株的RAPD标记遗传多样性研究试验，筛选、克隆和测序尖孢镰刀菌苦瓜专化型病菌的特异条带，对专一的RAPD标记设计特异引物，将该RAPD标记转换为SCAR标记，对SCAR标记的特异性进行验证，从而建立了尖孢镰刀菌苦瓜专化型分子标记快速鉴别技术体系。1.实验材料(I)尖孢镰刀菌菌株24个不同葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株(见表I )，用于RAPD标记的遗传多样性研究以及SCAR标记的特异性检测。表I 葫芦科瓜类作物枯萎病尖孢镰刀菌菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58?519，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAH)标记S58_519，其特征在于具有序列表SEQ.1D. No.1的喊基序列。2.根据权利要求1所述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58_519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。3.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_519，其特征在于具有序列表SEQ.1D. No. 2的喊基序列。4.根据权利要求3所述的尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_519，其特征在于扩增该标记的引物对具有序列表SEQ.1D. No. 3和SEQ.1D. No. 4的碱基序列。5.根据权利要求4所述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。6.一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有序列表SEQ.1D. No. 3和SEQ.1D. No. 4的喊基序列的引...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈振东，黄如葵，黎起秦，黄熊娟，袁高庆，黄玉辉，林纬，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。