本发明专利技术提供了一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：1)亚油酸合成酶基因(FgLAI12；FGSG_02668)的敲除；2)亚油酸合成酶基因缺失突变株(ΔFgLAI12)的鉴定；3)亚油酸合成酶基因缺失突变株代谢性能检测，包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的合成。本研究方法通过基因的敲除及敲除基因后的突变株的代谢性能检测，能够快速的研究出所敲除基因的功能以及所述基因与禾谷镰刀菌致病能力的联系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因功能研究方法领域，尤其涉及一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法。
技术介绍
引起赤霉病的主要致病菌是禾谷镰刀菌，禾谷镰刀菌是最早被发现的赤霉病致病菌，也是最重要的致病菌。禾谷镰刀菌产生的次级代谢产物-单端孢霉烯，是引发赤霉病的主要毒素，会造成寄主植物的死亡，严重危害小麦，大麦，玉米等农作物，引起产量损失，并且可破坏食用者免疫系统，引起呕吐、腹泻、头晕等症状，严重危害人类健康。但现有技术中传统育种和化学防治赤霉的方法防治收效甚微情况下，因此科学认识禾谷镰刀菌致病机理变得十分重要。硬脂酸对植物抵抗禾谷镰刀菌侵染十分重要，亚油酸是硬脂酸重要的上游合成物质。将亚油酸氧化为硬脂酸过程中，亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase LAI)是其重要限速酶之一。目前主要已知LAI主要有Cis-9LAI和Cis-12LAI，主要通过异构亚油酸，从而进一步被生化还原为硬脂酸。LAI且LAI对于真菌生长、有性生殖、控制毒素合成和色素合成代谢中起重要作用。但目前，对于禾谷镰刀菌中亚油酸代谢为硬脂酸的机理知之甚少，迫切的需要开发一种高效的研究禾谷镰刀中亚油酸代谢为硬脂酸的方法，对进一步揭开禾谷镰刀菌致病机理十分重要。本研究以禾谷镰刀菌中Cis-12LAI(FgLAI12；FGSG_02668)为例，专利技术了一种禾谷镰刀菌LAI功能基因研究方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步
骤：1)采用农杆菌介导的方法敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因，所述亚油酸合成酶基因为FGSG_02668；2)采用PCR筛选法鉴定所述敲除亚油酸合成酶基因后的突变株，确定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能，所述代谢性能包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的代谢。优选的，所述PCR筛选法所用的引物为：a：ACATGCCATTGTGATTG；b：AGGTGCGGTTGCTG；c：CTGACCAGTTGCCTAA；d：ACAGTTCATTCCGAGAC。优选的，所述的亚油酸的代谢通过HPLC-MS的方法和GC-MS的方法测定。优选的，所述的细胞色素合成酶P450的代谢通过P450-CO复合物吸收光谱检测。优选的，所述步骤1)具体为：亚油酸合成酶基因FGSG_02668的敲除包括以下步骤：a1)构建T-DNA载体；a2)进行T-DNA载体转化农杆菌及阳性克隆的筛选；a3)敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因。6.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研
究方法，其特征在于，所述步骤a3)具体为：培养禾谷镰刀菌孢子；诱导培养农杆菌；共培养禾谷镰刀菌和农杆菌；敲除突变体的潮霉素筛选和分离纯化。优选的，所述步骤a1)具体为：获取禾谷镰刀菌基因序列信息；提取禾谷镰刀菌基因组DNA；将所述提取到的基因组DNA进行PCR扩增，得到亚油酸合成酶基因；将所述扩增得到的亚油酸合成酶基因和与其连接的Prf-HU2载体进行双酶切，得到亚油酸合成酶基因酶切片段和Prf-HU2载体酶切片段；回收上述酶切片段，将上述酶切片段进行连接，得到带有亚油酸合成酶基因的T-DNA载体。优选的，所述PCR扩增用的引物为：FgLAI12-LB-F：GGAAGCTT CAAAGCGGCAACA；FgLAI12-LB-R：GGACTAGT TTCCCATCAACAACATA；FgLAI12-RB-F：GCGGGCCC GGCTTATCTCAACGACA；FgLAI12-RB-R：GCGAGCTC TACCCTGAATCCAACAT。优选的，步骤a2)中所述的T-DNA载体转化的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α感受态细胞。优选的，步骤a2)中所述的阳性克隆的筛选中的检测引物为：P1：CTTTTCTCTTAGGTTTACCCG；P2：TAATGCAGGAGTCGCATAAG；P3：CCCAAAAAGTGCTCCTTCAA；P4：TGTGCTGCAAGGCGATTAA。本专利技术提供的谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法通过基因的敲除及敲除基因后的突变株的代谢性能检测，能够快速的研究出所敲除基因的功能以及所述基因与禾谷镰刀菌致病能力的联系。附图说明图1为本专利技术技术方案路线图。图2为敲除突变株代谢产物检测结果，图2(A)为敲除突变体和野生型中代谢产物的HPLC的检测结果；图2(B)为亚油酸标准品HPLC的检测结果；图2(C)是HPLC检测亚油酸含量的变化数据结果；图2(D)是P450酶含量的变化数据结果。图3为突变株代谢产物GC-MS的结果。具体实施方式本专利技术提供了一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：1)采用农杆菌介导的方法敲除亚油酸合成酶基因，FGSG_02668，得到亚油酸合成酶基因缺失突变株；2)采用PCR筛选法鉴定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能。本专利技术所述的禾谷镰刀菌为本领域所公知的禾谷镰刀菌，对于具体的菌株无特殊限定，可直接从环境中分离得到或者购买市售的禾谷镰刀菌，具体的本专利技术实施例中使用的禾谷镰刀菌为专利技术人从环境中分离得到的禾谷镰刀菌Fg180378菌株。本专利技术在进行敲除亚油酸合成酶基因之前，优选首先从禾谷镰刀菌数据库(http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/)，在NCBI上Blast禾谷镰刀菌亚油酸合成酶基因功能基因序列，运用MEGA软件进行对比分析。根据如图1所示的定点敲除功能基因方法，运用引物设计软件：Primer5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.htmL分别设计目的基因上游和下游片段。本专利技术进行禾谷镰刀菌基因组DNA的提取，优选的禾谷镰刀菌基因组DNA的提取方法为CTAB法，具体的包括以下步骤：1)培养禾谷镰刀菌；2)用无菌microcloth过滤培养基，滤液在室温下离心；3)将所述离心得到的沉淀孢子转移到YPD液体培养基中，经过培养得到菌丝；4)将所述菌丝干燥后在冷冻条件下进行研磨，得到菌丝粉末；5)将所述菌丝粉末与CTAB提取缓冲液混合，得到悬浮液；6)将所述悬浮液65℃静置30分钟，每隔10分钟翻转离心管混匀；7)加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇到离心管混匀，轻摇20分钟后，离心得上清液1；8)将上清液转入新的离心管中，重复步骤10)的操作，得上清液2；9)将上清液2转移到新的离心管，加入RNaseA到终浓度5-50ug/mL，然后37℃静置30-60分钟；10)加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇，然后翻转离心管5分钟后离心得到上清液3，将上清液3转移到新的离心管中；11)用体积比为24：1的氯仿：异戊醇再抽提一次，去除酚，得到上清液4；12)将上清4转移到新的离心管，加入1/10体积的NaAc后再加入2倍体积的100％乙醇(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：1)采用农杆菌介导的方法敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因，所述亚油酸合成酶基因为FGSG_02668；2)采用PCR筛选法鉴定所述敲除亚油酸合成酶基因后的突变株，确定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能，所述代谢性能包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的代谢。
【技术特征摘要】
1.一种禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，包括以下步骤：1)采用农杆菌介导的方法敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因，所述亚油酸合成酶基因为FGSG_02668；2)采用PCR筛选法鉴定所述敲除亚油酸合成酶基因后的突变株，确定亚油酸合成酶基因缺失突变株ΔFgLAI12；3)检测所述亚油酸合成酶基因缺失突变株的代谢性能，所述代谢性能包括亚油酸的代谢和细胞色素合成酶P450的代谢。2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述PCR筛选法所用的引物为：a：ACATGCCATTGTGATTG；b：AGGTGCGGTTGCTG；c：CTGACCAGTTGCCTAA；d：ACAGTTCATTCCGAGAC。3.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述的亚油酸的代谢通过HPLC-MS的方法和GC-MS的方法测定。4.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述的细胞色素合成酶P450的代谢通过P450-CO复合物吸收光谱检测。5.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：亚油酸合成酶基因
\tFGSG_02668的敲除包括以下步骤：a1)构建T-DNA载体；a2)进行T-DNA载体转化农杆菌及阳性克隆的筛选；a3)通过农杆菌侵染，敲除禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因。6.根据权利要求5所述的禾谷镰刀菌中亚油酸合成酶基因功能的研究方法，其特征在于，所述步骤a3)具体为：培养禾谷镰刀菌孢子；诱导培养农杆菌；共培...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁鹏飞，张亚洲，郭帧儒，魏育明，郑有良，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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