大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，并公开了该蛋白激发子VdCP1在大丽轮枝菌侵染棉花中的应用以及在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。该蛋白激发子VdCP1可以明显的提高植物的抗性，且效果快，作用时间长。大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用
本专利技术涉及编码微生物蛋白质
，特别是涉及一种大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)分泌型蛋白激发子。
技术介绍
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的一种真菌病害，可危害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种，主要危害的大田作物包括棉花、茄子、番茄、烟草、马铃薯、西瓜、黄瓜、花生、大豆等，从而导致巨大的经济损失。大丽轮枝菌在分类地位上隶属半知菌亚门、淡色孢科、轮枝菌属真菌。目前对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是它们往往存在着无法摒除的弊端，尤其是作物遭受病原侵染后，没有有效的杀菌剂应对。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注。因此从该病原菌中寻找出具有新活性，新功能的有效物质已成为国内外科学家关注的热点。大丽轮枝菌产生的激发子是一种重要的效应分子。它通过识别并作用植物细胞表面的受体分子来传递病原菌侵染的信号，激发植物的防卫系统，诱导植物的防御反应，使植物最终产生系统获得性抗性。目前国内外从大丽轮枝菌中分离出能够引起植物抗病反应的活性成分并不多。2004年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离到一个蛋白激发子，该激发子能诱导植物氧爆发反应，并激发植物抗病相关蛋白基因的调控(J.Y.,Wang.等，ApplEnvironMicrobiol,2004,70：4989-95)；2012年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离得到了一种激发子，该激发子是一种小分子蛋白，能诱导植物过敏反应，氧爆发和抗病相关蛋白的积累，促进苯丙素合成途径，提升植物基础抗性(B.N.,Wang.等，ApplMicrobiolBiotechnol，2012，93：191-201)。后期实验进一步证明，2012年Wang.等人分离得到的蛋白激发子PevD1有效地诱导棉花系统抗病性，减轻棉花黄萎病的发病率(B.Bu,等，PlantCellRep，2014，33,461-470)；拟南芥转pevd1基因植物显著提高其抗病性，且促进拟南芥植物生长发育(M.Liu,等，Int.J.Biol.Sci.，2016，12,931-943)。所有已公开发表的文献表明，大丽轮枝菌确实可以产生引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同，但蛋白质序列和基因序列报道较少，所以寻找新的蛋白激发子，对揭示大丽轮枝菌与植物互作机理以及激发子提高植物免疫抗性是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种能够提高植物抗性及防御性的大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1及其氨基酸序列。本专利技术的第二目的是提供大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1的用途。本专利技术的第三目的是提供编码大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1的多核苷酸序列vdcp1。本专利技术的第四目的是提供含有vdcp1基因的载体及含有该载体的宿主细胞。一种大丽轮枝菌Verticilliumdahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术所述的蛋白激发子VdCP1在大丽轮枝菌侵染棉花中的应用以及在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。本专利技术所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其中，提高植物抗性和诱导植物防御反应中的植物为双子叶植物。本专利技术所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其中，双子叶植物优选为棉花和烟草；当用于诱导减少烟草灰霉病和丁香假单胞菌的危害时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM；当用于提高棉花对大丽轮枝菌的抗性时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM。一种vdcp1基因，其核苷酸序列为下列所述之一：(1)编码如SEQIDNO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。本专利技术所述的vdcp1基因，其多核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还包括一种含有权利要求上述任一种vdcp1基因的载体。本专利技术所述的载体，所述vdcp1基因可用于转化表达，表达载体优选pPICZαA，即其载体为在pPICZαA中插入vdcp1基因的重组载体。本专利技术还包括一种遗传工程的宿主细胞，含有上述的任一种载体。本专利技术所述遗传工程的宿主细胞，其中，重组载体可用毕赤酵母(PichiapastorisKM71H)表达，得到分子量约18kD的融合表达蛋白(RVdCP1)，可以诱导棉花、烟草等同类植物产生抗性反应，提高抗性能力，减少烟草灰霉病和丁香假单胞菌对烟草的危害，减轻大丽轮枝菌对棉花的危害。本专利技术所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得重组蛋白。本专利技术的优点为：(1)该蛋白激发子可以明显地激活植物免疫系统，提高植物的抗病性，增强植物抵抗病原菌侵染，有效地阻止或减轻病害的发生，且使用浓度低，起效快，作用时间长，具有广谱性；(2)该蛋白对应基因的敲除菌株出现明显致病力减弱，这一特点为今后大丽轮枝菌基因改造提供了基础，且敲除后的低致病力菌株具备作为低毒力对照菌株的潜力；(3)大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1为提高植物的抗病性提供了新的途径，为今后生物农药的开发与应用提供了资源，也为今后该基因转基因棉花提供了依据，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。下面结合微生物保藏信息及具体实施例对本专利技术的大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用作进一步说明。微生物保藏信息编号CGMCCNo.7611，命名Verticilliumdahliae，2013年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。具体实施方式实施例1vdcp1基因在大丽轮枝菌中的敲除和致病性检测大丽轮枝菌Verticilliumdahliae，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮枝菌在10～30℃均可生长，病菌生长的最适温度为20～25℃，33℃绝大多数菌株不生长，但有些菌株耐高温的能力较强，在33℃下仍能缓慢生长。微菌核对不良环境的抵抗力较强，能耐80℃高温和-30℃低温。微菌核萌发适温为25～30℃。菌落白色，初生菌丝体无色，后变橄榄褐色，有分隔；直径2-4μm；菌丝体常成膨胀状，可单根或数根菌丝芽殖成微菌核；分生孢子椭圆形，单细胞，大小4.0-11.0×1.7-4.2μm；由分生孢子梗末端逐个割裂。(1)vdcp1基因的敲除提取大丽轮枝菌基因组，利用引物对vdcp1aF(TGCTCCGTTCCAACCTTCTAGT)(如SEQIDNO:3所示)/vdcp1aR(GCCCAAAAATGCTCCTTCAAGTTGGAAGTTGAGGGGTGATT)(如SEQIDNO:4所示)，vdcp1bF(CCCTGGGTTCGCAAAGATAAGGCGTCTGCGTTATTAGAGGG)(如SEQIDNO:5所示)/vdcp1bR(AAGAACGGATCTATGACATGA)(如SEQIDNO:6所示)分别扩增vdcp1基因上上下游片段各1000bp(94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35cycles；72℃5min)，利用引物对Hyg-F(TTGAAGGAGCATTTTTGGGC)(如SEQIDNO:7所示)/Hyg-R(TTATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种大丽轮枝菌Verticilliumdahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的蛋白激发子VdCP1在大丽轮枝菌侵染棉花中的应用以及在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。3.根据权利要求2所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其特征在于：所述提高植物抗性和诱导植物防御反应中的植物为双子叶植物。4.根据权利要求3所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其特征在于：所述双子叶植物优选为棉花和烟草；当用于诱导减少烟草灰霉病和丁香假单胞菌的危害时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM；当用于提高棉花对大丽轮枝菌的抗性时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：邱德文，杨秀芬，曾洪梅，郭立华，袁京京，张易，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11