一种博宁霉素的生物合成制备方法技术

本发明专利技术提供一种博宁霉素（Ｚ－８９３）的生物合成制备方法，该方法采用向博宁霉素的产生菌轮枝链霉菌或轮枝链霉菌平阳变种的发酵培养基中添加末端胺体单乙酰精胺，然后发酵培养，并从培养液中回收博宁霉素。该方法使发酵产生的有效复合物中博宁霉素的含量比大幅度提高至５０～８５％。

The invention relates to a preparation method of biosynthesis of boningmycin.

The present invention provides a kind of boningmycin (Z - 893) biosynthesis preparation method, the method used to produce the Bonin fermentation by Streptomyces verticillatus or bacterium Streptomyces verticillus var. Pingyang added amino body monoacetyl fine medium culture and fermentation culture, amine, and recovered from the culture fluid by Bonin su. The content of the fermentation to produce effective compound azithromycin than Bo Ning increased to 50 ~ 85%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种博宁霉素(Z-893 )的制备方法，属于抗生素微 生物发酵培养领域。
技术介绍
博莱霉素族抗生素的分子结构博莱霉素A2 R= -NH(CH2)S(CH3)NH II博莱霉素B2 R=-NH-(CH 2)4-NH-C-NH 2博莱霉素A5 R= -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 博莱霉素A6 R= -NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)rNH2 博宁霉素 R=-NH-(CH2)rNH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3 其中，博宁霉素(Boningmycin)是由轮技链霉菌平阳变种产生 的，属于博莱霉素族的化合物(专利号为98101253.1，专利技术名称为一 种抗肿瘤抗生素和其微生物发酵生产法)。博宁霉素不但具有抗肿瘤 作用，而且对银屑病、脂溢性皮炎和乳头瘤病毒所致的疾病如尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用，毒性低，外用无刺激性，具有良好的应 用前景。但其通过发酵培养所产生的活性产物中博宁霉素仅占约5% 以下，甚至只有痕迹量。因此，为了适应工业化生产，并能有效降低成本，本专利技术的技术 人员通过继续研究，发现了一种高产率的博宁霉素生产方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种博宁霉素(Z-893 )的生物合成制备方 法，采用该方法发酵产生的活性产物中的博宁霉素含量高，活性产物 中博宁霉素的含量比例达到50~85%，具有良好的工业化生产前景。为了实现本专利技术目的，本专利技术所述的博宁霉素(Z-893 )的生物 方法，该方法包括如下步骤向轮技链霉菌(Streptomyces verticillus )或轮技链霉菌平阳变种 (Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)的发酵培养基中添 加博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，然后发酵培养，并从培养液中回 收博宁霉素。本专利技术所述的博宁霉素(Z-893 )的生物合成方法，其包括如下1) 将产生博宁霉素的轮技链霉菌(Streptomyces verticillus )或轮 枝《连霉菌平阳变种菌种(Streptomyces verticillus Var. Pingyangensis n. var)进行发酵培养得培养液，1升发酵培养基中含有0.3 ~ 0.6克的单 乙酰精胺；2) 对培养液进行提取、分离、精制而得博宁霉素。其中，本专利技术采用了经过选育优化的轮技链霉菌或轮枝链霉菌平 阳变种，其为已知菌种，有关其形态特征、培养特征、生理特征、碳 源利用和抗菌谱等已有文献记载(微生物学报V19(4)，361-364.1979 )。 优选为轮枝链霉菌平阳变种Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )或轮枝链霉菌6970 ( Streptomyces verticillus 6970)。当然，所有能够产生博宁霉素的菌种也都应属于本专利技术之列。本专利技术采用的用于培养微生物的培养基中应加入可被其利用的 碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被其利用的痕迹量营养物，这些成 份可预先一次性地加入培养基中或者间歇或连续地加入培养基中，实 现博宁霉素的高产率。在发酵培养基中需要加入博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，其加入量为0.03%~0.06%，所加末端胺体可以是单体游离碱，也可以是 它的各种无机酸盐，如盐酸盐或硫酸盐等；还可以是能与之成盐的有 机酸盐。可以是有机合成品，也可以是天然来源的提取品或粗提品； 其加入培养基的方式可以是预先一次性地加入，也可以釆用间歇地或 连续地加入。具体地说，本专利技术发酵培养基的组成为葡萄糖0.2~0.8%，淀 粉0.5 ~ 5.0%,豆饼粉0.5 ~ 6.0%,玉米粉0.5 ~ 5.0%,玉米浆0.1 ~ 2.0%,氯化钠0.1 ~ 0.5%，磷酸二氢钾0.005 ~ 0.03%,硫酸锌0.02 ~ 0.07%,硫酸铜0.001 ~ 0.020%，玉米油0.1-0.5%，单乙酰精胺 0.03% ~ 0.06%,其余为水，pH6.0~6.5。培养方式可采用振荡培养、搅拌培养或其它方式，但对大量生产 来说，优选的方式为浸没搅拌培养，培养条件(时间、湿度、pH等) 随菌种不同而变化，也随培养基成分的变化有所不同，本领域技术人 员能够根据具体情况进行选择，当发酵液的生物活性达到峰值时终止 培养，根据其性质进行分离纯化，所得活性复合物中博宁霉素的含量 比可以达到50~85%，经分离、纯化得到的含铜博宁霉素，通过紫外 光谱、质谱分析表明所得化合物确为博宁霉素。具体地说，本专利技术所述的发酵培养过程为将产生博宁霉素的轮 技链霉菌平阳变种菌种或轮枝链霉菌接种于斜面培养基上进行培养， 在28。C培养8天；然后将菌种斜面接种于种子培养基中，在28'C旋 转培养48小时后，再用于发酵，29。C培养7 8天后收获培养液。本专利技术所用的斜面培养基组成为葡萄糖1.0%，蛋白胨0.5%， 淀粉1.0%,氯化钠0.5%，琼脂2,0%,其余为水，调pH7.2 7.5。所述的种子培养基的组成为葡萄糖0.5%，淀粉2.5%,豆饼粉3.2%，玉米粉2.0%,玉米浆0.5%，氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.015%, 硫酸锌0.05%,硫酸铜0.01%,玉米油0.3%,自然pH。本专利技术所述的发酵培养基与种子培养基的成分基本相同，所不同 的是另加了博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺。所用培养基都需要进行灭菌， 一般于120 'C灭菌30分钟即可。 本专利技术所述培养液的提取、分离、精制过程为发酵培养液用草 酸调pH2.0-3.0， NaOH调pH5.0-6.5,离心上清液并过滤，滤液通 过离子交换树脂柱，无盐水洗后，以0.1 0.5NHC1洗脱，收集活性 洗脱液，调pH4.5-6.5,再经大孔吸附树脂柱脱盐，以5~30%的丙 酮(含0.01N HC1)溶夜洗脱，收集含铜复合物，进行 CM-Sephadex-C-25 (NH4+)柱层析，并以0.1 ~ 1NNH4C1梯度洗脱， 按峰位收集含铜活性色带，大孔吸附树脂柱脱盐后，经脱铜处理得博 宁霉素。本专利技术所述的博宁霉素的制备方法，以轮枝链霉菌为产生菌，通 过向发酵培养基中加入博宁霉素的末端胺体单乙酰精胺，使发酵产生 的有效复合物中博宁霉素的含量比大幅度提高至50~85%。附图说明图l为本专利技术所述发酵培养液提取、分离、精制流程图。 具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例l本实施例所用的产生博宁霉素的菌种为轮枝链霉菌平阳变种 Q835 ( Streptomyces verticillus var Pingyangesis n. sp Q835 )，其斜面培 养基组成为葡萄糖1.0%,蛋白胨0.5%，淀粉1.0%,氯化钠0.5% 和琼脂2.0%,其余为水。调pH7.2，于120 。C灭菌30分钟，将菌种 接种于此斜面培养基上，在28。C培养8天，将生长良好的菌种斜面 接种于经过120 t:灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成 为葡萄糖0.5%，淀粉2.5%,豆饼粉3.2%,玉米粉2.0%，玉米浆0.5%，氯化钠0.3%，磷酸二氢钾0.015%，硫酸锌0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种博宁霉素的生物合成制备方法，该方法包括如下步骤：先将产生博宁霉素的轮枝链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）或轮枝链霉菌平阳变种菌种（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ　Ｖａｒ．Ｐｉｎｇｙａｎｇｅｎｓｉｓ　ｎ．ｖａｒ）进行发酵培养得培养液；然后对培养液进行提取、分离、精制；其特征在于，发酵过程中１升发酵培养基中加入０．３～０．６克的单乙酰精胺。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许鸿章，陈汝贤，石莲英，鲁敏，张瑞，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]