一种大丽轮枝菌的致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因制造技术

本发明专利技术公开了一种大丽轮枝菌致病相关蛋白VdSENP1及其编码基因与应用。该蛋白VdSENP1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。本发明专利技术的蛋白和其编码基因对培育抗黄萎病棉花，以及提高棉花产量和品质具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）致病相关蛋白及其编码基因。
技术介绍
由土壤丝状真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）所引起的棉花黄萎病是威胁棉花生产的主要病害，多年来一直严重影响着我国棉花的品质和产量。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现(沈其益，1992),1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993,1995,1996,2002年在全国范围内连续大发生，损失严重。至今，我国大部分主产棉区己成为黄萎病重病区。黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)，属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。关于棉花黄萎病的致病机制有多种解释，其中以导管堵塞和中毒两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉(Garber,1966)。马远莉等(1990)对棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大(最大的有17.7%)，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等(1972)认为，黄萎病菌在代谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质一脂多糖的复合体。该复合物对感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内K+和Na+大量渗漏。而抗病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。Wang等(2004)从黄萎病原菌的菌丝中分离到一个新的具有对棉花叶片有致萎作用的蛋白VdNEP。该蛋白可以诱导烟草叶片形成坏死斑，也可以使拟南芥产生抗病反应，因此该蛋白可能参与了黄萎病菌对棉花侵染时的互作反应。但目前尚不清楚该蛋白是否与以前己分离的毒素蛋白是同一物质。现在越来越多的研究表明，黄萎病菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键生化因子，同时组织导管的阻塞影响水分运输可能加剧了病症的产生。大丽轮枝菌是一种土传真菌，在干燥恶劣的环境下能够产生其休眠结构微菌核，从而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成与其致病性息息相关。2004年，Dobinson KF等(Dobinson,K.F.,et al.,2004)利用改造了的EZ::TN转座系统，对来源于番茄的大丽轮枝菌的胰蛋白酶VTP1成功的进行了定向敲除。该基因能够促进微菌核的形成，但是敲除以后没有影响其致病性及生长特性。2005年，Dobinson KF等对来源于莴苣和番茄的大丽轮枝菌的细胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1进行了敲除。敲除VMK1后菌株对各种宿主的致病性严重衰退，说明MAP激酶介导的信号通路在真菌致病性上起着重要作用。并且基因的敲除减少了孢子的产生和微菌核的形成，说明该基因可能参与多个细胞进程。2006年Dobinson KF等(Klimes,A,et al,2006)又利用此系统对来源于番茄的大丽轮枝菌的类型2疏水蛋白基因VDH1进行了敲除。该基因的敲除减少了微菌核的产生，但不影响其致病性。对孢子的产生也没有影响，但影响了孢子对干燥环境的耐受力。说明VDH1基因的功能是多方面的，可能与大丽轮枝菌在土壤中长期的生存有关。2008年Dobinson KF等又研究了在微菌核的形成过程中VDH1基因的调控和表达，发现VDH1基因在微菌核、菌丝融合体及孢子中特异表达，进一步证明了该基因与微菌核的形成相关。由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。植物在与病原物的长期协同进化过程中获得了一系列复杂的防御机制保护自己，抗性表现为组成型抗性和诱导型抗性，诱导型抗性又包括组织结构抗性和生理生化抗性。对黄萎病抗性不同的棉花品种在组织结构方面存在一定差异，己被国内外不少研究证实。抗病品种木质部的细胞间隙较小，细胞壁较厚，且木质部中含有较多的髓射线。另外，抗病品种的导管腔和木质部的纤维腔直径小于感病品种，说明棉花品种对黄萎病的抗性与其具有坚实的木质部有关。棉花的生理生化抗病性方面己有过较多的研究，研究较多的抗病相关因子包括:植保素、单宁、可溶性糖、氨基酸及多种酶类。棉株在遭受病菌侵袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酚、植保素、单宁等，另外还与一些酶类、蛋白以及小分子物质如H2O2。它们的作用是非专化性，与植物的基础抗性相关。棉花抗黄萎病的机制是一个非常复杂的问题，涉及的因素众多，因此不断深入研究这些抗病反应产物在基因表达水平上的规律，对于进一步深入了解抗病机制和利用基因工程手段改造棉花品种抗性具有重要意义。抗病基因的获得是选育抗病品种的重要基础，目前通过分子生物学手段己经克隆的植物抗病基因大概有39个以上，其中抗病原真菌的大概有20多个，如拟南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因Ve，高梁抗普通锈病(Puccinia Sorghi)基因Rpl-D，且在海岛棉上已经克隆了NBS-LRR类抗病基因。在常规育种上，国内外棉花育种者一直重视抗源的筛选和创造。1983-1986年李成葆等161对911份陆地棉资源进行了抗黄萎病鉴定，筛选了抗性较好的一批抗(耐)病品种。K.V.Srinvasin鉴定了126个海岛棉品种的抗性，结果显示表现耐病和抗病的占85%。无论是通过常规方法寻找抗源，还是通过分子生物学手段克隆抗病基因都已经取得了一定的进展，但还没有找到真正防治棉花黄萎病的有效办法。根本原因在于棉花等作物遗传背景复杂，很难在分子水平进行更深入的研究，另外黄萎病菌(大丽轮枝菌，Veriicillium dahliae)小种分化变异性强等原因也为抗病遗传育种带来重重困难。因此，研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理就至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来自大丽轮枝菌Veriicillium dahliae的致病相关蛋白，名称为VdSENP1(Sentrin-specific Protease1)。本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下1）或2）的蛋白：1）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下1）或2）的蛋白：
1）序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取
代和/或缺失和/或添加且与真菌致病相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸
序列之一：
1）序列表中SEQ ID №：1的第383-3577位核苷酸所示的核苷酸序列；
2)序列表中SEQ ID №.1所示的核酸序列；
3）编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；
4）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序
列；
5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能
蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭惠珊，赵云龙，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11