一种小麦赤霉病抗性鉴定方法技术

本发明专利技术属于植物抗性鉴定领域，涉及一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，以一叶一心期至二叶一心期的小麦叶片为检测对象，将叶片切割为叶段后在叶段中部接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液使叶片接菌，并在接种2‑3天后即可获得鉴定结果，与单花滴注法相比，本发明专利技术方法可以在小麦苗期利用离体叶片进行赤霉病抗性鉴定，同时具有鉴定周期短，操作简单，重复性好和能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点，该发明专利技术的发布能够有效促进小麦抗赤霉病遗传、育种及抗病机理等工作取得突破性研究进展。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于植物抗性鉴定领域，涉及一种小麦赤霉病抗性鉴定方法。
技术介绍
：小麦(TriticumaestivumL.)作为世界三大粮食作物之一，其产量仅次于玉米和水稻。然而，在小麦整个生长发育过程中，各种生物胁迫和非生物胁迫严重威胁着小麦的产量和品质。其中，非生物胁迫因素主要包括盐碱、干旱、冻害和干热风等；生物胁迫因素主要包括小麦三锈病害(包括条锈、叶锈和秆锈)、小麦赤霉病和小麦白粉病等，这三大病害是威胁小麦生长最为严重的三大真菌病害。其中，真菌病原菌不仅能够影响小麦的产量，而且在侵染小麦的过程中能够分泌许多对人类和家畜有害的毒素和代谢产物，严重影响小麦的品质。赤霉病(FusariumHeadBlight,FHB)是一种由多种镰刀菌引起的世界范围重大真菌病害，该病害主要发生在湿润和半湿润地区，主要危害作物包括小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻和黑麦等多种禾谷类作物。小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的穗部重大真菌病害，每年都给世界范围内小麦生产带来较大的损失。此外，赤霉菌在侵染过程中还会产生多种真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等，不仅影响小麦的品质及商品价值，还可使人、畜中毒，严重危害人畜健康。随着赤霉病的频繁爆发和危害面积的不断扩大，赤霉病害已引起了人们的广泛关注。小麦赤霉病抗性可能受多基因控制，抗病机制复杂，其发病程度易受环境条件影响，遗传力低，抗性鉴定困难，抗性资源匮乏，目前尚未发现对赤霉病免疫的种质资源，这些都在一定程度上影响了小麦赤霉病抗性的遗传和育种工作。现在小麦赤霉病鉴定方法主要是单花滴注法，其主要特征是：在小麦开花期对穗中部小穗的基部小花接种10μL禾谷镰刀菌悬浮液，孢子浓度为每亳升1×105个，每个材料需要做20-30个重复，接种后套透明塑料袋保湿，待赤霉病发病后(大约接种后72小时)去除塑料袋。接种后21天观察并统计发病小穗数和总小穗数，并计算出每穗感病率，通过统计学分析方法判断小麦的赤霉病抗性。该方法具有抗病鉴定周期长，鉴定时期要求特殊，鉴定结果不稳定、易受环境条件和个人主观因素的影响等缺点。如何能够快速准确的鉴定小麦赤霉病抗性成为现有技术中难以解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的诸多不足之处，本专利技术以一叶一心期至二叶一心期的小麦叶片为检测对象，将叶片切割为叶段后在叶段中部接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液使叶片接菌，并在接种2-3天后即可获得鉴定结果，与单花滴注法相比，本专利技术方法可以在小麦苗期利用离体叶片进行赤霉病抗性鉴定，同时具有鉴定周期短，操作简单，重复性好和能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点，该专利技术的发布能够有效促进小麦抗赤霉病遗传、育种及抗病机理等工作取得突破性研究进展。与现有的大田接种相比，本专利技术避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，节省大量人力物力，适合大批量的育种材料高通量的鉴定。本专利技术是通过如下技术方案实现的：包括如下步骤：利用一叶一心期至二叶一心期的小麦苗期叶片，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，在圆形伤口部位接种1-2.5uL浓度为1.5-2×105个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每份鉴定材料至少做3个重复；之后将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部；将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，无菌去离子水的深度不超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中；之后将上述的叶段转移至25-28℃培养箱中，培养2-3天，根据接菌部位病症类型统计检测材料的赤霉病抗性，标准如下：感病品种在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶段表面迅速蔓延，接种后第3天病斑在叶片扩展的最大长度可以达到0.6-1.0cm、颜色较浅，叶段整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；抗病品种在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病品种相比，其病斑的颜色深，病斑长度小于0.5cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片不发生脱绿现象。按照上述标准即可筛选出高赤霉病抗性的小麦品种并用于后期的育种工作中。上述技术方案中，在叶段上制造的圆形贯穿伤口能实现禾谷镰刀菌孢子均匀的向周围组织蔓延，有效消除重复间差异；而且能使禾谷镰刀菌菌丝迅速侵入叶片组织，并从叶片组织中获得充足的营养而繁殖快速；本专利技术所述方法利用一叶一心期至二叶一心期的小麦，挑选健壮的植株进行抗病性鉴定。相同材料可以选用多棵一叶一心期幼苗进行赤霉病鉴定，单株的抗病鉴定可以选用二叶一心期幼苗进行抗病性鉴定，这样不仅能保证有足够的叶片进行重复试验，而且能有效缩短抗病鉴定周期，避免长时间的栽培影响植株生长状态进而降低抗病鉴定结果的稳定性和准确性；本专利技术使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的浓度为1.5-2×105个/mL，使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的体积为1-2.5uL，所述方法满足接种总孢子量的需求，加快叶段病症发生速度，提高检定效率和结果稳定性。由于本专利技术的叶段上有贯穿性创伤，这种条件下使用禾谷镰刀菌孢子接种浓度如果高于2×105个/mL，则病害发展过快无法鉴定品种间抗性差异；如果浓度过低会延长抗病鉴定周期，长时间的离体培养会降低叶片活性，影响鉴定结果；固本专利技术选择上述浓度标准。本专利技术所述方法在接种完成后将两端浸水的叶段转移至25-28℃培养箱，鉴定效果最好，培养箱温度高于28℃会导致接种部位菌丝大量繁殖，影响判定结果的准确性；进一步的，所述无菌去离子水中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，其浓度为25mg/L。6-BA为叶片保绿剂，加入6-BA后可以有效减缓叶片脱绿速度，延长叶片活性时间，提高鉴定结果的稳定性和准确性；进一步的，所述接种前在振荡器上涡旋禾谷镰刀菌孢子悬浮液1-2min，使禾谷镰刀菌孢子悬浮液混合均匀，颠倒混匀禾谷镰刀菌孢子悬浮液，能显著提高同一待检测小麦材料不同重复发病情况的均一性；进一步的，所述叶段两端通过插入具有直径0.5cm小孔的鉴定板(一般选择塑料板)置于无菌去离子水中，无菌去离子水水面低于塑料板的表面，便于叶段两端长时间稳定的置于无菌去离子水中，实现叶段在鉴定过程中的稳定性；进一步的，所述圆形贯穿伤口的直径为0.1-0.15cm，实现伤口大小均匀一致，提高鉴定的准确性和一致性；进一步的，本专利技术的采用的禾谷镰刀菌种为典型强致病力菌种，具体采用传统菌种PH-1，该菌种广泛易得，在本专利技术中能够准确鉴定不同小麦材料的赤霉病抗性，鉴定结果感抗差异显著，易于判断。与单花滴注法相比，本专利技术提供了一种新的小麦赤霉病抗性评价标准，以是否产生黑色致密病斑为抗性评判指标。该方法可以避免单花滴注法通过统计发病小穗率来评判小麦的赤霉病抗性，减少个人主观性对鉴定结果的影响。本专利技术所述方法还包括赤霉菌分生孢子的培养：选用禾谷镰刀菌为抗性鉴定菌种(如传统菌种PH-1)，首先将禾谷镰刀菌在马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满马铃薯葡萄糖固体培养基后，切取带菌丝的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：利用一叶一心期至二叶一心期的小麦苗期叶片，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3‑3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，在圆形贯穿伤口部位接种1‑2.5uL浓度为1.5‑2×105个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每份鉴定材料至少做3个重复；之后将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部；将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中；接种完成后将上述的叶段转移至25‑28℃培养箱中，培养2‑3天，根据接菌部位病症类型统计检测材料的赤霉病抗性，标准如下：感病品种在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶段表面迅速蔓延，接种后第3天病斑在叶片扩展的最大长度可以达到0.6‑1.0cm、颜色较浅，叶段整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；抗病品种在接种2‑3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病品种相比，其病斑的颜色深，病斑长度小于0.5cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片不发生脱绿现象。...

【技术特征摘要】
1.一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：利用一叶一心期至二叶一心期的小麦苗期叶片，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，在圆形贯穿伤口部位接种1-2.5uL浓度为1.5-2×105个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每份鉴定材料至少做3个重复；之后将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部；将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中；接种完成后将上述的叶段转移至25-28℃培养箱中，培养2-3天，根据接菌部位病症类型统计检测材料的赤霉病抗性，标准如下：感病品种在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令让，赵兰飞，王宏伟，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37