一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法技术

本发明专利技术涉及生物防治技术领域，具体公开了一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。本发明专利技术直观简便，通过观察有色抑菌圈，克服了传统琼脂平板扩散法用于中药或其它性状相似待测物的体外抗菌试验时由于色深混浊和成分复杂导致难以准确测量抑菌圈直径的弊端。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物防治
，具体涉及一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法。
技术介绍
体外抗菌试验是在体外测定微生物对某种物质的敏感程度的试验，常用于评价抑杀病原菌的活性，已广泛地应用与科研、生产和临床，如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测定、指导临床用药的药敏试验等。琼脂平板扩散法是目前最常用的方法之一。传统的琼脂平板扩散法是将指示菌涂布于琼脂表面或均匀混入琼脂中，然后采用纸片法、牛津杯法、打孔法等方法加入待测物，让待测物在琼脂中扩散。由于琼脂无色透明、细菌无色半透明，导致细菌不生长的琼脂区域呈无色透明。若待测物有抗菌活性，其中的细菌等微生物生长受到抑制或杀灭，从而在药物有效浓度的范围内形成微生物不生长的透明圈a1(图1)，在光线较好的环境下辨别测量该透明圈a1的直径用于评价待测物有无抗菌活性及初步评价其活性大小。该透明圈称为抑菌圈，抑菌圈直径大小与抗菌物质浓度和指示菌浓度直接相关。大量的临床应用研究表明，中药具有不可忽视的抗菌作用。随着临床抗生素应用中出现的耐药细菌问题日趋严重，抗菌中药的研究具有广阔的应用前景。目前中药的体外抗菌活性研究尚无标准化方法，琼脂平板扩散法作为国际通用的抗生素抗菌活性评价方法之一，也被广泛引用到包括中药在内的其他材料的抗菌活性测定中。然而，中药提取液性状特殊，其在琼脂平板中扩散现象不同于抗生素，中药体外抗菌试验不能完全照搬抗生素体外抗菌试验。中药提取液主要特点有：(1)色深混浊：药物扩散后导致琼脂中出现颜色较深及混浊的药物扩散圈，该圈与细菌不生长的透明圈重合，影响抑菌圈直径的测量，难以直观评价抗菌活性大小。如图2所示：琼脂平板上(01)(02)两孔中为色深混浊的黄芩水提液扩散抗菌现象，其中b1为深棕色中药扩散圈(内圈)，b2为浅棕色中药扩散圈(外圈)；(03)(04)两孔为无色澄清的抗生素头孢曲松钠扩散抗菌现象，其中b3为透明抑菌圈，可见：采用传统平板琼脂扩散法进行抗菌试验时，抗生素无色澄清，其药物扩散圈不掩盖透明抑菌圈易于测量，而中药色深混浊掩盖了透明抑菌圈，需仔细甚至无法观察细菌不生长区域导致难以辨别测量抑菌圈；(2)成分复杂：抗生素一般成分单一，其离扩散中心远近不同药物仅浓度不同而成分相同。但中药提取物等往往成分复杂，各成分扩散速度不同，离扩散中心远近位置不同的药物的浓度和成分均有不同，因此细菌不生长圈的大小不仅与药物浓度有关还与药物复杂的成分相关。综上所述，传统的琼脂平板扩散试验在中药及与其性状相似的色深混浊及成分复杂的待测物的体外抗菌活性评价中尚存在弊端，寻找一种更加直观有效地指示其抗菌活性的体外抗菌方法对于抗菌物质的开发具有重要的应用价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，可分层显示色深混浊和成分复杂的中药提取物及性状相似的抗菌物质的体外抗菌活性，简便、直观、有效。为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。优选地，所述体外抗菌活性试验的具体步骤如下：将待测物溶液加入到新鲜制备的含菌亚甲基蓝琼脂平板上，使其在琼脂中扩散，恒温培养，待指示菌和待测物作用后，观察并测量待测物周围蓝色圈或待测物自身颜色与蓝色的混合有色圈直径作为抑菌圈的直径，并观察抑菌圈颜色深浅，评价待测物体外抗菌活性。优选地，所述含菌亚甲基蓝琼脂平板的制备方法如下：将斜面培养基活化生长6-8h的菌种制备成指示菌菌悬液，然后将指示菌菌悬液与灭菌后冷却至45℃融化的含有亚甲基蓝的药敏琼脂迅速混匀，冷却凝固，即得。优选地，所述含菌亚甲蓝琼脂平板中亚甲基蓝的含量为：每100mL含菌亚甲基蓝琼脂中含有2mL的1％亚甲基蓝水溶液。优选地，所述药敏琼脂为M-H琼脂培养基或其它适宜细菌生长的药敏琼脂。优选地，所述待测物溶液加入含菌亚甲蓝琼脂平板中的方法采用打孔法、纸片法、牛津杯法中的任一种。优选地，所述指示菌和待测物作用时间为18h。评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法应用于无色澄清及成分单一的抗菌物质。评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法应用于中药及性状相似的色深混浊及成分复杂的抗菌物质。本专利技术的主要原理是：待测物在琼脂中扩散并作用于琼脂中的细菌，细菌生存状态影响含菌亚甲基蓝琼脂平板的颜色。亚甲基蓝的氧化态和还原态分别呈蓝色和无色。细菌培养前琼脂中的亚甲基蓝通常处于显蓝色的氧化态，因此亚甲基蓝含菌平板呈蓝色。待测物加入亚甲基蓝含菌平板恒温培养后，随着细菌的培养，亚甲基蓝进入细菌细胞内，生长中的细菌的还原酶使亚甲基蓝脱色由蓝色变还原态的无色，而被杀灭或者抑制处于静息状态的细菌的还原酶失活不产生脱色作用，因此亚甲基蓝仍为蓝色。可见，含菌亚甲基蓝琼脂平板中无色的区域为细菌生长区域，蓝色的区域为细菌死亡或被抑制的区域(且蓝色的深浅与细菌活性大小相关)。综合考虑扩散至琼脂中待测物颜色，蓝色以及蓝色与待测物颜色混合色的有色圈区域为抗菌区域，即抑菌圈；无色区域和仅为待测物颜色的区域为无抗菌区域。本专利技术与传统琼脂平板扩散法相比，具有以下有益效果：1、改善色深混浊对透明抑菌圈观察的影响：本专利技术通过蓝色直观显示待测物对细菌的抑杀作用，结合待测物溶液自身的颜色观察有色区域，综合评价抗菌作用大小，有效克服了传统琼脂平板扩散法中由于待测物溶液的颜色和混浊对透明抑菌圈观察的影响，可直观快速地评价抗菌作用；2、改善成分复杂对待测物琼脂扩散的影响：中药及其他成分复杂的物质，其在琼脂中扩散时，不同成分扩散速度不同，本专利技术通过蓝色直观显示待测物所有成分的抗菌作用，对于具有多个抑菌成分的待测物，分层显示多个蓝色抑菌圈或蓝色和自身颜色的混合色抑菌圈，克服了传统琼脂平板扩散法中由于中药等待测物成分复杂，不同物质扩散位置不一的影响，可分层客观地综合评价成分复杂待测物总体的抗菌活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1传统琼脂平板扩散法抗生素的透明抑菌圈：a1-透明抑菌圈；图2传统琼脂平板扩散法中药和抗生素抑菌现象：b1-深棕色中药扩散圈(内圈)，b2-浅棕色中药扩散圈(外圈)，b3-透明抑菌圈；图3抗生素传统琼脂平板扩散法和亚甲基蓝琼脂平板扩散法结果比较：图3-a，传统琼脂平板扩散法，d1-透明抑菌圈；图3-b，亚甲基蓝琼脂平板扩散法，d2-蓝色抑菌圈；图4中药水提液传统平板琼脂扩散法和亚甲基蓝琼脂平板扩散法方法结果对比：图4-a，艾叶水提液传统琼脂平板扩散法，e1-深棕色中药扩散圈(内圈)，e2-浅棕色中药扩散圈(外圈)；图4-b，艾叶水提液亚甲基蓝琼脂平板扩散法，e3-深绿色中药抑菌圈(内圈)，e4-浅绿色中药抑菌圈(外圈)；图4-c，赤芍水提液传统琼脂平板扩散法，e5-浅棕色中药扩散圈；4-d，赤芍水提液亚甲基蓝琼脂平板扩散法，e6-蓝绿色中药抑菌圈；图5五味子和乌梅水提液亚甲基蓝琼脂扩散法抗菌试验结果：图5-a，五味子水提液抗肠炎沙门菌试验结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，其特征在于，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。

【技术特征摘要】
1.一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，其特征在于，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。2.如权利要求1所述的评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，其特征在于，所述体外抗菌活性试验的具体步骤如下：将待测物溶液加入到新鲜制备的含菌亚甲基蓝琼脂平板中，使其在琼脂中扩散，恒温培养，待指示菌和待测物作用后，观察并测量待测物周围蓝色圈或待测物自身颜色与蓝色的混合有色圈直径作为抑菌圈的直径，并观察抑菌圈颜色深浅，评价待测物体外抗菌活性。3.如权利要求2所述的评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，其特征在于，所述含菌亚甲基蓝琼脂平板的制备方法如下：将斜面培养基活化生长6-8h的菌种制备成指示菌菌悬液，然后将指示菌菌悬液与灭菌后冷却至45℃融化的含有亚甲基蓝的药敏琼脂迅速混匀，冷却凝固，即得。4.如权利要求3所述的评价抗菌物质...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晔，孔彦龙，姚传福，宋峰亮，马慧慧，许鹏程，
申请(专利权)人：安徽理工大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34