一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，所述的方法是将甘薯黑斑病菌菌株接种在P+S培养基上，培养7‑21d，再制备分生孢子悬浮液；在分生孢子悬浮液中加入甘薯叶片组织液，继续培养，直至分生孢子悬浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌发并获得最佳观察效果，进行镜检。本发明专利技术结合甘薯黑斑病菌的特性，通过反复的实验论证，得到一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发的方法，该方法能够使甘薯黑斑病菌分生孢子萌发率稳定在90％以上，并确定了最佳观察时间，满足了杀菌剂药剂筛选试验的必要条件，为筛选防治甘薯黑斑病的药剂，评估药剂的抗药性风险以及其他需要借助分生孢子萌发来完成的试验顺利进行提供了保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，特别涉及一种利用甘薯叶片组织液促进特定培养条件下甘薯黑斑病菌的分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法。
技术介绍
甘薯黑斑病是甘薯大田栽培期及储藏期的主要病害，每年由于该病造成的产量损失一般为5％～10％，危害严重时可达20％～50％，甚至更高。同时，病薯还会产生甘薯黑斑霉酮(ipomeamarone)和甘薯黑斑霉二酮(ipomeanine)等有毒物质，人和家畜食用后可引起中毒，甚至死亡，因此甘薯黑斑病的防治成为甘薯病害防治的重点。甘薯黑斑病的防治主要是依赖于杀菌剂的使用，但是现有的杀菌剂存在药剂品种单一、抗药性风险增加的问题，因此筛选新的防治药剂成为甘薯黑斑病的研究方向。筛选新的防治药剂的关键步骤之一就是进行室内的药效评价，即通常利用抑制病原真菌孢子萌发试验(NY/T1156.1-2006)和抑制病原真菌菌丝生长试验(NY/T1156.2-2006)来评价药剂的保护和治疗作用。由于甘薯黑斑病菌(Ceratocystisfimbriata)的分生孢子在水滴中萌发率极低，无法满足“药效评价标准”中分生孢子稳定萌发90％以上的试验要求，造成药剂筛选工作无法进行。因此建立一种简单、稳定的提高甘薯黑斑病菌分生孢子萌发率的技术体系，是本领域亟待解决的技术问题，也是农药生测和相关抗药性研究的必要条件。目前关于如何保证侵染甘薯的黑斑病菌分生孢子萌发率在90％以上及保持稳定萌发并获得最佳观察效果的方法国内外文献均无报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，该方法能够使甘薯黑斑病菌分生孢子萌发率稳定在90％以上，并确定了最佳观察时间。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，所述的方法是将甘薯黑斑病菌菌株接种在P+S培养基上，培养7-21d，再制备分生孢子悬浮液；在分生孢子悬浮液中加入甘薯叶片组织液，继续培养，直至分生孢子悬浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌发并获得最佳观察效果，进行镜检。所述的甘薯黑斑病菌菌株为甘薯长喙壳(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，保藏编号：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述的P+S培养基的制备方法为：将马铃薯、甘薯去皮切块，称取马铃薯块20g、甘薯块100g混合，加水煮烂，过滤，滤液中加入葡萄糖0.02g、琼脂粉13g，再加水定容至1L。所述甘薯黑斑病菌株在P+S培养基上培养的条件为：24-26℃、黑暗条件下。所述制备分生孢子悬浮液的方法为：用无菌水冲洗培养基表面的菌体即得。所述的分生孢子悬浮液中分生孢子浓度为1×106个/ml。所述的甘薯叶片组织液的制备方法为：将1g甘薯叶片组织加2ml水研磨离心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯叶片组织液，-20℃避光保存；使用时，室温溶解，使用后重新置于-20℃避光保存，甘薯叶片组织液的有效期从制备完成开始计，为3周。所述的甘薯叶片组织液的加入量为每1ml分生孢子悬浮液加入15-30μl甘薯叶片组织液。所述的继续培养直至分生孢子悬浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌发并获得最佳观察效果的条件为：24-26℃、黑暗条件下，培养2.5-3h至分生孢子芽管长度为2-4个分生孢子长度。本专利技术的有益效果：1、本专利技术结合甘薯黑斑病菌的特性，通过反复的实验论证，最终得到一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发的方法，该方法能够使甘薯黑斑病菌分生孢子萌发率稳定在90％以上，并确定了最佳观察时间，满足了杀菌剂药剂筛选试验的必要条件。2、本专利技术的方法能够保证同一批培养的菌株，在7-21d的培养时间内任意时段制备的分生孢子悬浮液，均可达到90％以上的萌发率，满足了使用同一批菌株在不同时间制备分生孢子悬浮液进行大量药剂筛选的需求，提高了药剂筛选的效率和准确性。3、本专利技术在分生孢子悬浮液中加入甘薯叶片组织液，能够显著提高甘薯黑斑病菌孢子萌发率，实验证明，当甘薯叶片组织液的加入量达到每1ml分生孢子悬浮液加入15-30μl甘薯叶片组织液时，分生孢子悬浮液中分生孢子的萌发率稳定在90％以上。4、本专利技术通过限定甘薯黑斑病菌的培养基配方和培养条件，分生孢子萌发的培养条件，进一步保证了甘薯黑斑病菌的生长和分生孢子萌发的稳定性。5、本专利技术明确了甘薯叶片组织液的保存条件和持效性，使整个操作进一步简化高效。6、本专利技术方法简单，可操作性强，为筛选防治甘薯黑斑病的杀菌剂提供了必要条件，为评估药剂的抗药性风险以及其他需要借助分生孢子萌发来完成的试验顺利进行提供了保证。附图说明图1为未加入甘薯叶片组织培养液的分生孢子悬浮液培养3h后的分生孢子萌发情况图。图2为加入甘薯叶片组织培养液(20μl/ml)的分生孢子悬浮液培养3h后的分生孢子萌发情况图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。本专利技术实施例中所用到的甘薯新鲜叶片均采自甘薯品种商薯19。实施例1实验材料的制备甘薯黑斑病菌株：甘薯长喙壳(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，分离自四川带病薯块，纯化、鉴定后保存；保藏编号：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。P+S培养基：将马铃薯、甘薯去皮切块，称取马铃薯块20g、甘薯块100g混合，加水煮烂(此次的加水量不超过1L)，过滤，滤液中加入葡萄糖0.02g，琼脂粉13g，再加水定容至1L。甘薯叶片组织液：将1g甘薯叶片组织加2ml水研磨离心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯叶片组织液，-20℃避光保存；使用时，室温溶解，使用后重新置于-20℃避光保存。以下实施例中组织液为甘薯叶片组织液的简称。实施例2分生孢子在组织液刺激下萌发率和芽管长度与时间的关系挑取甘薯黑斑病菌菌株，接种在P+S培养基的中心部位，25℃、黑暗条件下培养，然后分别选取培养10d和16d的甘薯黑斑病菌菌株，用无菌水冲洗培养基表面的菌体，得到含有分生孢子的冲洗液，再用无菌水调整冲洗液中分生孢子浓度，显微镜镜检，最终配制成分生孢子浓度为1×106个/ml的分生孢子悬浮液。在两种分生孢子悬浮液中分别加入甘薯叶片组织液，组织液的加入量均为每1ml分生孢子悬浮液加入20μl组织液。将加入组织液的分生孢子悬浮液在25℃、黑暗条件下继续培养1h、2h、2.5h、3h、4h，对不同培养时间的分生孢子悬浮液中分生孢子萌发的情况进行镜检，结果见表1。表1分生孢子在组织液刺激下萌发率和芽管长度与时间的关系根据表1的试验结果，25℃黑暗培养1h后，两种分生孢子悬浮液的分生孢子萌发率分别为：25.69％和13.71％，芽管长度可达到3/4个孢子长度。培养2h后，两种悬浮液的分生孢子萌发率分别为：97.00％和97.06％，芽管长度可达到1.5个孢子长度。培养2h后的分生孢子萌发率基本不再增加，但芽管长度进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，其特征在于，所述的方法是将甘薯黑斑病菌菌株接种在P+S培养基上，培养7‑21d，再制备分生孢子悬浮液；在分生孢子悬浮液中加入甘薯叶片组织液，继续培养，直至分生孢子悬浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌发并获得最佳观察效果，进行镜检。

【技术特征摘要】
1.一种促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，其特征在于，所述的方法是将甘薯黑斑病菌菌株接种在P+S培养基上，培养7-21d，再制备分生孢子悬浮液；在分生孢子悬浮液中加入甘薯叶片组织液，继续培养，直至分生孢子悬浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌发并获得最佳观察效果，进行镜检。2.根据权利要求1所述的促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，其特征在于，所述的甘薯黑斑病菌菌株为甘薯长喙壳(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，保藏编号：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。3.根据权利要求1所述的促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，其特征在于，所述的P+S培养基的制备方法为：将马铃薯、甘薯去皮切块，称取马铃薯块20g、甘薯块100g混合，加水煮烂，过滤，滤液中加入葡萄糖0.02g、琼脂粉13g，再加水定容至1L。4.根据权利要求1所述的促进甘薯黑斑病菌分生孢子稳定萌发并获得最佳观察效果的方法，其特征在于，所述甘薯黑斑病菌株在P+S培养基上培养的条件为：24-26℃、黑暗条件下。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德胜，张振臣，王爽，秦艳红，乔奇，田雨婷，王永江，白瑞英，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41