一种快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于快速鉴定中国小麦赤霉病菌种类的方法，所述方法是由小麦赤霉病菌鉴定材料的采集、Chelex-100 DNA快速提取方法与引物PCR扩增检测组成。利用该方法可以对中国小麦赤霉病菌种类进行快速的鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法，用于快速鉴定待检测小麦赤霉病菌的种类。
技术介绍
小麦赤霉病是一种世界性病害，在各小麦生产国家普遍发生，尤其是在气候潮湿多雨的地区严重危害。中国是小麦赤霉病发生频率最高和受危害最严重的国家之一，小麦赤霉病造成的小麦产量损失已经成为了小麦产量的主要损失之一，在一般发病年份造成10%-15%的减产，严重发病损失可达20%-40%。小麦赤霉病在小麦各个生育期均可危害，以穗部危害为主；在其危害过程中会产生DON毒素残留于籽粒中降低小麦品质，食用后会引起人畜中毒。多种镰刀菌可引起小麦赤霉病，主要有禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，镰刀菌亚洲型(Fusariumasiaticum)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)，不同种类菌株的致病力存在显著差异，且目前缺少免疫或高抗的小麦品种。因此加强小麦赤霉病菌不同种类的检测与预报对其防治有重要意义。目前，对于小麦赤霉病菌种的鉴定方法繁杂，首先需要分离病菌并进行培养，再提取DNA进行鉴定，费时费工，因此需要开发一整套简便、快速的鉴定方法。Chelex-100法快速提取DNA的方法已广泛应用于真菌菌丝基因组DNA提取，但在小麦赤霉菌尤其小麦赤霉菌分生孢子提取DNA未见报道；DNA分子特异性标记技术在真菌的种群分布和遗传多样性方面的应用也得到了的快速发展。目前用于快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法还很少，也不够系统，本专利开发一整套系统的、简便的可用于快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法。专利
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术所述DNA提取不需要对小麦赤霉病菌进行培养，直接采集小麦病穗材料即可，提取方法为Chelex-100快速提取法，所用特异标记引物序列为Fg11，由序列表中上游序列（21个碱基）和下游序列（21个碱基）组成（表1），该引物扩增可获得410bp或497bp条带。表1用于检测小麦赤霉菌的两引物上下游序列引物名称上游序列下游序列Fg115'CTCCGGGATATGTTGCGTCAA3'5'GGTAGGTATCCGACATGGCAA3'本专利技术应用的具体方法为：采集带有粉红色霉层的小麦赤霉病穗，刮取适量病菌组织，利用Chelex-100法快速提取DNA。本专利技术应用中所述的Chelex-100提取DNA方法（约10分钟）：1、刮取适量病菌组织置于1.5mL离心管中；2、向离心管中加入30~40μL20%的Chelex-100，并与病组织混匀；3、将离心管放入沸水浴中水浴2~3分钟，取出在旋涡混合器上振荡10s，然后再沸水浴5min；4、12000r/min离心3min或4℃静置过晚，上清液即可作为PCR模板。本专利技术应用中所述的PCR扩增：以Chelex-100法提取的DNA为模板，用引物Fg11进行PCR扩增。PCR反应体系（20µl）：模板DNA2µl，Taq酶0.2µl，上、下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL，dNTPs（10mmol·L-1）0.4μL，10×PCRBuffer缓冲液2μL，用无菌超纯水补充反应体系至20μL；PCR反应程序为：94预变性℃5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。本专利技术应用中所述的扩增产物检测是：对扩增产物在1％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳分离，利用紫外凝胶成像仪观察结果，，或在10％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色；当扩增产物有410bp条带时，待测小麦赤霉病菌为Fusariumgraminearum，当扩增产物有497bp条带时，待测小麦赤霉病菌为Fusariumasiaticum。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本专利技术提供了一个新的快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法，利用该方法可快速鉴定小麦赤霉病菌的种类，可在中国小麦赤霉病菌种类的鉴定、监测等应用中发挥重要的作用。具体实施方式采集小麦赤霉菌病穗，所采集病穗要求为带有粉红色霉层（含分生孢子）的小麦病穗；提取小麦赤霉病菌DNA采用Chelex-100，Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂；用于鉴定小麦赤霉病菌种类的PCR扩增引物，是由序列表（表1）中引物Fg11的上下游核苷酸序列组成的引物对。应用该方法快速鉴定小麦赤霉病菌种类的具体方法如下：1、待鉴定材料的采集鉴定材料要求采集带有粉红色霉层（含分生孢子）的小麦病穗，以其上的粉红色霉状物为试验材料。2、小麦赤霉病菌基因组DNA提取1）用刮刀直接刮取小麦赤霉病穗上适量的粉红色霉状物并置于1.5mL灭菌的离心管中；2）用移液器于上述离心管中加入30~40μL20%的Chelex-100，混匀；3）离心管置于沸水中水浴2~3min，取出后在旋涡混合器上振荡10s，再沸水浴5min；4）取出离心管12000r/min离心3min或4℃静置过晚，上清液即可作为PCR模板。3、以Fg11为引物、待测小麦赤霉病菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（20µl）：模板DNA2µL，Taq酶0.2µL，上、下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL，dNTPs（10mmol·L-1）0.4μL，10×PCRBuffer缓冲液2μL，用无菌超纯水补充反应体系至20μL；反应程序：94℃预变性5min，：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。4、扩增产物检测：在扩增产物中加入非变性载样指示剂，在浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶中电泳分离，利用紫外凝胶成像仪观察结果，或在10％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色；若扩增产物中含有410bp条带，则待测小麦赤霉菌为Fusariumgraminearum，若含有497bp条带，则待测小麦赤霉菌为Fusariumasiaticum。所述非变性载样指示剂组成为：0.25％(w/v)溴酚蓝，0.25％(w/v)二甲苯腈和40％(w/v)蔗糖，溶剂为蒸馏水。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，Chelex-100螯合树脂来自北京索莱宝科技有限公司；所用引物的由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验例：采集41份带有粉红色霉层（含分生孢子）的小麦赤霉病穗，用刮刀直接刮取病穗上适量的粉红色霉状物（含分生孢子）置于1.5mL灭菌的离心管中；移液器于上述离心管中加入30~40μL20%的Chelex-100，混匀；离心管置于沸水中水浴2~3min，取出后在旋涡混合器上振荡10s，再沸水浴5min；取出离心管进行12000r/min离心3min或4℃静置过晚，上清液即可作为PCR模板。然后以Fg11F/R为引物，41份小麦赤霉病穗上赤霉病菌的基因组DNA为模板，进行PCR检测，PCR反应体系（20µL）：模板DNA2μL，Taq酶0.2μL，上、下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL，dNTPs（10mmol·L-1）0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌超纯水补充反应体系至20μL。PCR反应程序为：94℃预本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法，是由小麦赤霉病菌的采集、Chelex‑100 DNA快速提取法和引物Fg11的PCR扩增检测组成的一套体系。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴定小麦赤霉病菌种类的方法，是由小麦赤霉病菌的采集、Chelex-100DNA快速提取法和引物Fg11的PCR扩增检测组成的一套体系。2.权利要求1所述的菌种的采集、Chelex-100DNA快速提取法和引物Fg11在鉴定小麦赤霉病菌种类中的应用。3.根据权利要求2所述的菌种的采集、Chelex-100法和引物Fg11在鉴定小麦赤霉病菌种类中的应用，其特征在于：采集需要鉴定的小麦赤霉病穗材料，用Chelex-100法快速提取小麦赤霉病菌基因组DNA作为模板，以引物Fg11进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测；扩增产物若含有410bp条带，则待测小麦赤霉病菌为Fusariumgraminearum，若含有497bp条带，则待测小麦赤霉病菌为Fusariumasiaticum。4.根据权利要求3所述的小麦赤霉病穗材料的采集、Chelex-100法和引物Fg11在鉴定小麦赤霉病菌种类中的应用，其特征在于，所述的鉴定材料的采集、基因组DNA的提取与PCR扩增：鉴定材料的采集：从田间采集具有粉红色霉层（含分生孢子）的小麦赤霉病病穗用于鉴定；基因组DNA的提取：用刮刀直接刮取小麦病穗上适量的粉红色霉状物（主要为分生孢子）置...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫红飞，张林，李令蕊，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13