一种基于液相芯片技术的禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的高通量检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的检测引物和探针组合及其检测方法。该引物探针组合由正向引物tub2F，反向引物tub2R，三种抗药突变型及野生型探针167m、198m、200m、167w、198w、和200w组成。本发明专利技术的检测方法可同时检测三种不同的抗药突变类型，并且通量高，特异性、扩展性强，信噪比、灵敏度及自动化程度高，实用性强，可满足抗多菌灵禾谷镰刀菌的快速检测，为科学合理用药提供了依据。

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相芯片技术的禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的高通量检测方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的检测引物和探针组合及其检测方法。
技术介绍
由禾谷镰刀菌引起的麦类赤霉病是一种毁灭性的病害，在亚洲、欧洲、加拿大和美国北部等地频繁爆发。病菌能在收获前仅仅几周的时间内在小麦穗部迅速扩展，阻碍种子形成并使麦粒萎缩，造成严重的经济损失。除此之外，其病原物镰刀菌代谢产生单端孢霉烯族毒素污染食物和饲料还可造成人类和动物严重疾病和免疫力下降(PestkaandSmolinski2005)，阻止真核生物蛋白质合成(Uenoetal.，1973)。因此，造成食品安全上的重大隐患。由于长期缺乏有效的抗病品种，对于麦类赤霉病主要采取化学防治。多菌灵(苯并咪唑类)是应用最多的一种化学药剂，在扬花期进行喷雾防治，取得了很好的效果。自从1970年沈阳化工研究院实现多菌灵的工业化生产以来，苯并咪唑类药剂在我国应用于赤霉病已有近四十年的历史。周明国等(1999)于1992年在浙江海宁的病穗中分离到世界上首例小麦赤霉病菌对多菌灵的田间抗性菌株。此后分别在浙江、江苏、上海等地对小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性进行了连年系统监测，发现在这些地区已形成抗药性群体。陈长军等(2004)对浙江，江苏，安徽，河南，山东和河北等省份小麦赤霉病的抗药性情况从1985～2006年进行了监测。结果发现，在赤霉病爆发的年份，随着用药量的增加，抗性菌株频率上升迅速。但在发病较轻年份，加上农业产业结构调整和小麦市场价格的影响，小麦种植面积减少，用药水平下降，抗性菌株频率又有一定的回落(张艳军，2009)。自2008年以来，我国小麦赤霉病频繁爆发，病原菌的抗性频率也快速上升，已严重影响其防效。因此，及时快速的检测小麦赤霉菌群体对多菌灵的抗性频率，能够为杀菌剂的科学合理使用提供重要依据。病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性主要是其β微管蛋白基因上的发生点突变，使与杀菌剂结合的靶标位点的氨基酸序列改变，造成杀菌剂的结合力降低从而产生抗性。Chen等(2009)和Qiu等(2011)通过对敏感和抗药型菌株β2微管蛋白基因的敲除互补实验发现，167位和200位苯丙氨酸转换成酪氨酸以及198位谷氨酸转换成赖氨酸或谷氨酰胺的突变能引起禾谷镰刀菌对多菌灵的抗药性，其中167位突变为主要类型。抗药机制的解析为分子检测技术的研发提供了依据。测定禾谷镰刀菌对多菌灵的敏感性常规方法为菌落直径法。配制含有一系列浓度梯度的含药平板，通过测定菌落直径计算抑制率，从而鉴定抗药菌株。菌落直径法具有明显的缺点，其工作量大、耗时长，并且易受药剂纯度以及环境因素的影响，而使结果发生偏差。而禾谷镰刀菌对多菌灵抗药突变位点的发现，为开发高通量分子生物学检测方法提供了依据。近年来，已经有基于抗药突变位点的快速分子检测方法的报道。如Duan等(2015)开发了针对F167Y突变类型的环介导等温扩增检测技术，Hou等(2011)建立了同样针对F167Y抗药突变的荧光定量检测法，Hou等(2013)开发了检测F167Y、E198K和F200Y的ARMS-PCR检测法。与菌落直径法相比，这些分子检测方法大大提高了检测效率以及准确性。但这些方法每次只能检测一种突变类型，如果要准确检测所有抗药突变就需要进行多次反应，这就在一定程度上影响了检测效率。液相芯片技术(Luminex)是近几年发展起来的一种高通量单核苷酸多态性(SNP)分型方法。此方法通过不同颜色荧光微球标记的SNP探针与模板杂交后进行位点特异性延伸，延伸产物采用Luminex公司的液相芯片系统进行检测。每个反应可以检测高达500个指标，并且灵敏度高，延伸产物检测完全自动化，每小时可完成96个样品。由于在SNP检测方面的高通量性，液相芯片技术近年来在病原物检测方面得到了广泛应用，如Ducey等(2007)利用该技术建立了李斯特菌的检测方法，Ward等(2008)根据41个SNP位点开发了41条探针，在一个反应内通过41个指标的检测，能够一次鉴定出11个种的镰刀菌及其毒素化学型。但在病原物抗药性检测方面，还未有报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对以上存在的问题，本专利技术的目的是提供一组检测禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的引物及探针组合，能够同时检测F167Y、E198K和F200Y三种抗药突变。本专利技术的另一目的是提供上述禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性菌株的液相芯片检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：1.一种用于检测禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性的MLGT引物探针组合，其特征在于由正向引物tub2F，反向引物tub2R，三种抗药突变型及野生型探针167m、198m、200m、167w、198w、和200w组成，各引物及探针序列如下：2.tub2F：5’-CGCGAGGTTGAGAACTGTGACC-3’；3.tub2R：5’-GCCATGACGGTGGAAATCAGGT-3’；4.167m：5’-cataatcaatttcaactttctactTCGCATGATGGCCACCTA-3’；5.167w：5’-tacttctttactacaatttacaaTCGCATGATGGCCACCTT-3’；6.198m：5’-caaatacataatettacattcactCGTTATCGATACAGAAGGTCTG-3’；7.198w：5’-acacttatctttcaattcaattacCGTTATCGATACAGAAGGTCTC-3’；8.200m：5’-aatttcttctctttctttcacaatAGAGCCTCGTTATCGATACAGT-3’；9.200w：5’-atactttacaaacaaataacacacAGAGCCTCGTTATCGATACAGA-3’；10.所述引物组合在检测抗多菌灵禾谷镰刀菌中的应用。(1)目的片段的扩增采用引物tub2F和tub2R对靶标序列进行扩增的PCR体系为：20μl体系包含两条引物各0.5μM，2xPrimerStarpremix10μl，模板DNA0.1～1ng。反应程序：94℃变性90s；然后94℃30s，50℃30s，68℃1.5min，40个循环，最后68℃延伸7min。(2)扩增产物的纯化产物纯化采用天根公司的N96DNA产物纯化试剂盒(DP213-01)，具体步骤：①板平衡：将96孔吸附板CB2叠放在96孔浅孔板上，每孔中加入200μl的平衡液BL，3600rpm离心3min，弃废液，将吸附板重新放回浅孔板上。②估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入3倍体积的结合液PB。③充分混匀后转移所有上述混合液到第一步平衡过的96孔吸附板CB2中。室温放置2min，3600rpm离心5min，弃废液，将吸附板重新放回同一浅孔板中。④向96孔吸附板CB2每孔中加入200μl漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，3600rpm离心3min，弃废液，将吸附板重新放回同一浅孔板中。⑤重复第4步骤。⑥将吸附板放回浅孔板中，3600rpm离心10min，目的是将吸附板中残余的漂洗液去除。⑦将96孔吸附板CB2置于一个无菌干净的96孔浅孔板中，向吸附板各孔膜的中间部位悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性的MLGT引物探针组合，其特征在于由正向引物tub2F，反向引物tub2R，三种抗药突变型及野生型探针167m、198m、200m、167w、198w、和200w组成，各引物及探针序列如下：tub2F：5’‑CGCGAGGTTGAGAACTGTGACC‑3’；tub2R：5’‑GCCATGACGGTGGAAATCAGGT‑3’；167m：5’‑cataatcaatttcaactttctactTCGCATGATGGCCACCTA‑3’；167w：5’‑tacttctttactacaatttacaaTCGCATGATGGCCACCTT‑3’；198m：5’‑caaatacataatcttacattcactCGTTATCGATACAGAAGGTCTG‑3’；198w：5’‑acacttatctttcaattcaattacCGTTATCGATACAGAAGGTCTC‑3’；200m：5’‑aatttcttctctttctttcacaatAGAGCCTCGTTATCGATACAGT‑3’；200w：5’‑atactttacaaacaaataacacacAGAGCCTCGTTATCGATACAGA‑3’；...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禾谷镰刀菌对多菌灵抗药性的MLGT引物探针组合，其特征在于由正向引物tub2F，反向引物tub2R，三种抗药突变型及野生型探针167m、198m、200m、167w、198w、和200w组成，各引物及探针序列如下：tub2F：5’-CGCGAGGTTGAGAACTGTGACC-3’；tub2R：5’-GCCATGACGGTGGAAATCAGGT-3’；167m：5’-cataatcaatttcaactttctactTCGCATGATGGCCACCTA-3’；167w：5’-tacttctttactacaatttacaaTCGCATGATGGCCACCTT-3’；198m：5’-caaatacataatcttacattcactCGTTATCGATACAGAAGGTCTG-3’；198w：5’-acacttatctttcaattcaattacCGTTATCGATACAGAAGGTCTC-3’；200m：5’-aatttcttctctttctttcacaatAGAGCCTCGTTATCGATACA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，冯洁，徐进，许景升，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11