本发明专利技术涉及分子标记，具体公开了一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术利用PCR技术对该标记进行扩增，可通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检番茄样品是否为抗灰叶斑病材料，进而实现对抗灰叶斑病番茄的辅助选育及快速鉴定。本发明专利技术不仅为番茄抗灰叶斑基因Sm的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗灰叶斑病的番茄新品种提供了高效途径。本发明专利技术基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有灰叶斑抗性的番茄新品种的方法，可以在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
【技术实现步骤摘要】
与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记及其扩增引物与应用
本专利技术涉及分子标记，具体地说，涉及与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记。
技术介绍
番茄灰叶斑病(Tomatograyleafspot)是近年来新流行的一种病害，该病病原菌为匍柄霉属(StemphyliumWallroth)真菌，是一类丝状暗色砖格孢真菌，可以引起多种蔬菜病害。该病在世界范围内均有发生，温暖潮湿地区尤为严重。近年来，番茄灰叶斑病在我国南方和北方的春夏季普遍发生，在早春保护地特别是保护地硬果型番茄栽培中危害较为严重，常会造成番茄品质下降和产量锐减，给番茄生产造成严重影响，给农民造成了巨大的损失。目前，已经挖掘了一些抗灰叶斑病的番茄种质资源，前人也利用了其中一些抗病材料对番茄灰叶斑病抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究。Behare等(1991)利用番茄感病材料Moneymaker与抗病材料Motelle进行杂交后自交，获得124株F2群体，通过RFLP图谱分析，将基因Sm定位于番茄11号染色体T10和TG110之间，二者距离为10.9cM。2009年JiandScott报道了一个能够检测Sm基因的Caps标记CT55，该标记是一个隐性标记，PCR产物约为400bp，经DdeI酶切后，感病材料和杂合材料产生330bp、200bp和140bp左右的条带，而抗病材料中产生200bp和140bp的条带，该标记不能区分感病材料与杂合材料，且其尚未在番茄种质资源中验证应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记及其扩增引物与应用。本专利技术开发了一个与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，利用PCR技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检番茄样品是否为抗灰叶斑病材料，进而实现对抗灰叶斑病番茄的辅助选育及快速鉴定。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，或含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。SEQIDNo.1所示的核苷酸序列长度为158bp。第二方面，本专利技术提供用于扩增所述Indel标记的引物，所述引物的核苷酸序列如下：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。第三方面，本专利技术提供一种具有灰叶斑病抗性番茄的筛选方法，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，扩增产物若含有158bp的权利要求1所述Indel标记，表明番茄材料具有灰叶斑病抗性。第四方面，本专利技术提供所述引物在筛选番茄种质资源上的应用，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，根据扩增产物差异，实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。进一步地，所述番茄材料包括但不限于番茄的种子、幼苗、叶片、根、茎。优选为幼嫩叶片。所述番茄材料的基因组DNA通过本领域的常规方法提取，如：取番茄植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA。进一步地，前述扩增产物差异，指产物电泳条带类型的差异。扩增出一条170bp的条带，为感灰叶斑病隐性纯合材料；扩增出一条170bp的条带和一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性杂合材料；扩增出一条158bp的条带，为抗灰叶斑病显性纯合材料。可选择抗灰叶斑病显性纯合材料作为育种材料，使后代为抗灰叶斑病显性。通过上述方法，可以准确、高效地在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选。不需要对扩增片段进行测序，仅通过产物电泳条带类型的差异即可准确实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。作为优选，所述PCR扩增的总反应体系为10μL，其中：DNA模板(50ng·μL-1)2μL，权利要求2所述引物(10μmol·L-1)各0.25μL，2×GoGreenMasterMix(Promega公司产品)5μL，双蒸水2.5μL。作为优选，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，32个循环；72℃保温6分钟，4℃保存。上述PCR反应体系和反应程序能使PCR反应顺利进行，保证引物最大效率的进行扩增。对扩增产物进行凝胶电泳检测时，采用3％琼脂糖凝胶电泳分离检测。上样量8μL，电泳时电压为180V，时间为：1.5～2.0h；或采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于180V恒功率电泳分离1.5h，最后银染显色。第五方面，本专利技术还提供了含有所述引物的检测试剂盒。所述试剂盒的其他组分可为常规选择，只要能实现利用所述引物实现PCR扩增即可。本专利技术的有益效果在于：本专利技术不仅为番茄抗灰叶斑基因Sm的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗灰叶斑病的番茄新品种提供了高效途径。本专利技术基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有灰叶斑抗性的番茄新品种的方法，可以在番茄候选材料的任何阶段对其进行灰叶斑抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。本专利技术通过利用23份不同遗传背景的番茄资源进行验证，结果表明Sm-Indel验证的正确率为100％。附图说明图1为本专利技术实施例2中用Sm-Indel标记验证番茄亲本材料H1706(P1)、892-43(P2)、F1以及F2群体随机单株的部分琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳检测结果；其中，P1：H1706(感灰叶斑病，S)；P2:892-43(抗灰叶斑病，R)。图2为本专利技术实施例2中用Sm-Indel标记验证23份不同遗传背景的番茄材料的琼脂糖电泳检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。生物材料的来源和记载出处：实施例所用的试验材料为品种H1706和高代自交系892-43。以H1706为母本，892-43为父本杂交，获得F1，自交获得F2群体。番茄品种H1706(P1)：从美国番茄遗传资源中心(TomatoGeneticsResourceCenter)引进。该品种是由美国人CharlieJohn在20世纪60年代中期选育而成的加工类型番茄品种，有限生长类型，早熟，果实椭圆形，中等大小，抗枯萎病和黄萎病。该品种是国际番茄基因组计划的测序品种，在2012年的《Nature》第485期的第630页有记载。番茄高代自交系892-43(P2)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的鲜食番茄抗病自交系，无限生长类型，中早熟，幼果无绿果肩，成熟果粉红色。果实圆形，平均单果重220克左右，抗番茄叶霉病，番茄花叶病毒病(TMV)和灰叶斑病(新发现)。为现有已知品种，在本课题组高振华等人1995年发表在《中国蔬菜》第5期第11-14,21页的文章《番茄新品种中杂9号》中有记载。23份不同遗传背景的番茄材料的具体来源和出处详见Lin本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，或含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.用于扩增权利要求1所述Indel标记的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。3.一种具有灰叶斑病抗性番茄的筛选方法，其特征在于，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，扩增产物若含有158bp的权利要求1所述Indel标记，表明番茄材料具有灰叶斑病抗性。4.权利要求2所述引物在筛选番茄种质资源上的应用，其特征在于，以番茄材料的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行PCR扩增，根据扩增产物差异，实现番茄灰叶斑病抗性的鉴定或辅助选育。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述扩增产物差异，指产物电泳条带类型的差异：扩增出一条17...
【专利技术属性】
技术研发人员：高建昌，苏晓梅，杜永臣，李宝聚，黄泽军，王孝宣，国艳梅，谢学文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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