本发明专利技术公开了一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，纹枯病菌引物的序列如下：上游引物P1：5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物P2：5′-CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA-3′。本发明专利技术建立的多重PCR检测体系，可以同时检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种病原真菌。本发明专利技术扩增产物片段大小与预期结果一致，并且5对引物仅对目标特异，无非特异条带产生，因而能很好的区分5种病原菌。简便快速：4小时完成样品制备和检测，同时检测出小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、根腐蠕孢菌等5种病原物；灵敏度高：可以检测出0.39ng的病原物DNA样品；准确：检测结果准确性高于传统的分离鉴定和症状鉴定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农作物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用多重PCR检测小麦田5种土传真菌病原物的方法的建立及应用。
技术介绍
小麦土传真菌病害包括纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病等，这些病害均可以造成小麦的严重减产，是目前威胁小麦安全生产的重要病害。而且这些病害经常混合发生，弓丨起更大的损失。早期诊断可以为病害的防控提供依据，但是这些真菌病害均属于土壤习居菌，引起症状在苗期很难区分，传统的早期鉴定手段无法快速准确得到结果。分子生物学的发展和PCR技术的诞生为快速、准确检测病原菌提供了基础。根据微生物基因组的保守区段设计特异性引物用于检测病原菌的方法已得到了广泛的应用。根据asiaticum 和/7. graminearum tri6区域和tri3区域序列差异，设计筛选了特异性引物，构建了这两种病原菌的多重PCR检测体系，方便、快捷的将/7. asia ticum和F. graminearum区分开来。目前的研究结果表明，引起小麦纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病等的病原物主要有7J'麦纹才古病菌cereali5 )>lif (Gaeumannomyces graminis var.tri tici )、禾谷镰刀菌(F. graminearum )、假禾谷镰刀菌(F. pseudograminearum )和根腐 (.Bipolaris sorokiniana )
技术实现思路
本专利技术提供一种同时快速检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种土传真菌病原的方法，合成同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，优化了多重PCR反应体系，可以同时特异性检测5种土传真菌病原，此方法具有实验周期短、灵敏度闻、准确性闻等优点。本专利技术的技术方案是 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物， 纹枯病菌引物的序列如下 上游引物 Pl :5' - TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3'； 下游引物 P2:5' - CGGirGAGCTGGGTCITTTA -3'； 假禾谷镰刀菌引物的序列如下 上游引物 P3:5' - CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3'； 下游引物 P4:5' - GAGAATGTGATGACGACAATA -3'； 小麦全蚀病菌引物的序列如下 上游引物 P5:5' - TATGTCAGAGCGGTGAACG -3'； 下游引物 P6:5' - ITCGGTGCCTGGATAGTGA -3'； 根腐蠕孢菌引物的序列如下上游引物 P7 :5' - CGAGCAAGITGTCAAGGAG -3'； 下游引物 P8 :5' - GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3'； 禾谷镰刀菌引物的序列如下 上游引物 P9:5' - ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3'； 下游引物 PlO :5' - TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3'。一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的检测方法，提取病原菌的DNA后，进行多重PCR检测，多重PCR反应体系为10XPCR buffer 2. 5u L,3. 125UTaq酶，dNTP Mixture0. 4mM, Mg2+ 3mM, Pl 0. 4 u L, P2 0. 4 u L, P3 I. 4u L, P41. 4u L, P51. 4u L, P61. 4u L,P70. 7u L, P80. 7 u L, P9 0. 7 u L, PlO 0. 7 u L, ddH20 补至 25 u L。 多重PCR反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性Imin、58. 5°C退火lmin、72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸IOmin ;于4°C条件下保存。本专利技术的有益效果是本专利技术建立的多重PCR检测体系，可以同时检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种病原真菌。本专利技术扩增产物片段大小与预期结果一致，并且5对引物仅对目标特异，无非特异条带产生，因而能很好的区分5种病原菌。简便快速4小时完成样品制备和检测，同时检测出小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、根腐蠕孢菌等5种病原物；灵敏度高可以检测出0. 39ng的病原物DNA样品；准确检测结果准确性高于传统的分离鉴定和症状鉴定方法。附图说明图I为五种病原菌单重PCR检测结果，泳道M :分子量标准DL2000 ;1，2 :禾谷镰刀菌；3，4 :纹枯病菌；5，6 :假禾谷镰刀菌；7，8 :全蚀病菌；9，10 :根腐蠕孢菌N空白对照； 图2为多重PCR检测结果，M :分子量，1，2，3泳道为三次重复多重检测结果，N:阴性对照； 图3不同浓度DNA多重PCR检测结果，M:分子量标准DL2000，I :1/2 2 :1/4，3 :1/8，4:1/16，5:1/32，6:1/64，7:1/128。具体实施例方式一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物， 纹枯病菌引物的序列如下 上游引物 Pl :5' - TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3'； 下游引物 P2:5' - CGGirGAGCTGGGTCITTTA -3'； 假禾谷镰刀菌引物的序列如下 上游引物 P3:5' - CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3'； 下游引物 P4:5' - GAGAATGTGATGACGACAATA -3'； 小麦全蚀病菌引物的序列如下 上游引物 P5:5' - TATGTCAGAGCGGTGAACG -3'； 下游引物 P6:5' - ITCGGTGCCTGGATAGTGA -3'； 根腐蠕孢菌引物的序列如下 上游引物 P7:5' - CGAGCAAGITGTCAAGGAG -3'；下游引物 P8 :5' - GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3'； 禾谷镰刀菌引物的序列如下 上游引物 P9:5' - ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3'； 下游引物 PlO :5' - TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3'。一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的检测方法，提取病原菌的DNA后，进行多重PCR检测，多重PCR反应体系为10XPCR buffer 2. 5u L,3. 125UTaq酶，dNTP Mixture0. 4mM, Mg2+ 3mM, Pl 0. 4 u L, P2 0. 4 u L, P3 I. 4u L, P41. 4u L, P51. 4u L, P61. 4u L,P70. 7u L, P80. 7 u L, P9 0. 7 u L, PlO 0. 7 u L, ddH20 补至 25 u L。多重PCR反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性lmin、58. 5°C退火lmin、72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸IOmin ;于4°C条件下保存。本专利技术具体操作如下 I.材料和方法 I.I实验材料 I.I. I菌株5种菌株都由河南农业大学农业生物技术重点实验本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，其特征在于：纹枯病菌引物的序列如下：上游引物？P1：5′？？TCCTCCCGCTTATTGATATGC？？3′；下游引物？P2：5′？？CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA？？3′；假禾谷镰刀菌引物的序列如下：上游引物？P3：5′？？CGGGGTAGTTTCACATTTCCG？？3′；下游引物？P4：5′？？GAGAATGTGATGACGACAATA？？3′；小麦全蚀病菌引物的序列如下：上游引物？P5：5′？？TATGTCAGAGCGGTGAACG？？3′；下游引物？P6：5′？？TTCGGTGCCTGGATAGTGA？？3′；根腐蠕孢菌引物的序列如下：上游引物？P7：5′？？CGAGCAAGTTGTCAAGGAG？？3′；下游引物？P8：5′？？GTGAAAGTCTCAATAGCACCC？？3′；禾谷镰刀菌引物的序列如下：上游引物？P9：5′？？ACAGATGACAAGATTCAGGCACA？？3′；下游引物？P10：5′？？TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA？3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李洪连，陈清清，孙炳剑，张煜，施艳，袁虹霞，邢小萍，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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