检测KRAS突变的试剂及方法技术

本发明专利技术涉及检测KRAS突变的试剂及方法。揭示了一类特别适合于扩增和鉴定出KRAS密码子12、13及61位置处基因突变的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，可以快速地鉴定出同一密码子的不同碱基的突变，也可以快速地鉴定出同一基因不同密码子的突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及检测KRAS突变的试剂及方法。
技术介绍
目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR单克隆抗体药西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。这些药物能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。但是，临床试验表明这些靶向药物仅对部分肿瘤患者有显著的疗效。进一步的研究发现，肿瘤组织中KRAS基因发生突变(体细胞突变)的肿瘤患者对此类靶向药物完全耐药。因此，检测肿瘤患者KRAS基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。 Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种-H-ras、KRAS和N_ras，分别定位在11、12和I号染色体上。作为原癌基因的ras基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因通过突变而激活。其中，KRAS则对人类癌症影响最大，正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则不受上游EGFR的信号影响，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡。这是具有突变型KRAS基因患者对抗EGFR药物治疗无效的理论基础。根据上述可见，临床上准确、快速地判断肿瘤患者是否存在KRAS基因的突变是决定用药策略的关键。因此，非常有必要优化检测突变型KRAS基因的新试剂，以快速、全面、准确地鉴定出突变型KRAS基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测KRAS突变的试剂及方法。在本专利技术的第一方面，提供一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂，所述的试剂是引物组合，选自下组用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合正向引物SEQ ID NO :3、SEQID NO 4、SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 和反向引物 SEQ ID NO 9 ；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合正向引物SEQ ID N0:18和反向引物SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQID NO :16、SEQ ID NO 17 ;或用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合正向引物SEQ ID NO 19, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24 和反向引物 SEQ ID NO 25。在另一优选例中，SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5被制成混合的引物。在另一优选例中，SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8被制成混合的引物。在另一优选例中，SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14被制成混合的引物。在另 一优选例中，SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17被制成混合的引物。在另一优选例中，所述的试剂同时包括用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合和用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合。在本专利技术的另一方面，提供所述的试剂的用途，用于制备检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂盒。在本专利技术的另一方面，提供一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有选自所述的一种或多种引物组合。在另一优选例中，所述的试剂盒中同时含有用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合和用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有PCR扩增试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有核酸提取试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有核酸序列分析软件；和/或使用说明书。在本专利技术的另一方面，提供一种(体外非诊断性地)检测样品中是否存在KRAS基因变异的方法，所述的方法包括以核酸样品为模板，利用所述的引物组合对进行PCR扩增，若是获得扩增产物，则表明检测样品中存在KRAS突变。在另一优选例中，通过琼脂糖凝胶电泳来分析PCR扩增后是否获得扩增产物。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I显示了利用针对KRAS密码子12的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。图2显示了利用针对KRAS密码子13的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。图3显示了利用针对KRAS密码子61的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。图4显示了密码子12突变(GGT — GCT)的DNA模板相应位置的序列测定结果。图5显示了密码子13突变(GGC — GAC)的DNA模板相应位置的序列测定结果。图6显示了密码子61突变(CAA — CAT)的DNA模板相应位置的序列测定结果。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于扩增和鉴定出KRAS密码子12、13及61位置处基因突变的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，可以快速地鉴定出同一密码子的不同碱基的突变，也可以快速地鉴定出同一基因不同密码子的突变。KRAS 基因KRAS基因是Ras基因家族中与人类肿瘤相关的基因。其全长基因序列参见GenBank登录号NM_004985. 3 ;其编码的蛋白的序列参见GenBank登录号NP_004976. 2。KRAS突变的最常见的方式就是点突变，多发生在第12、13和61密码子，占所有突变率的90%以上，其中又以第12密码子突变最常见，密码子GGT的前2个核苷酸可分别突变成A/C/T、A/C/T。第13密码子GGC的前2个核苷酸可分别突变成A/C/T、A/C/T。第61密码子CAA的3个核苷酸可分别突变为A、T、T0 KRAS基因的突变导致细胞逃逸凋亡，这种异常在胰肠癌、大肠癌、肺癌等肿瘤组织中发生率较高。据国外文献报道，最高为胰外分泌腺癌，达90%，结肠癌为40 50%，肺癌和膀胱癌为13%，而胃癌较低在10%以下。因此这几种癌症中KRAS基因野生型患者使用靶向EGFR药物的疗效也比较显著，特别是结肠直 肠癌，美国癌症综合网络(NCCN)已把KRAS突变的检测列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。KRAS基因变异的检测试剂或试剂盒基于KRAS基因与人类肿瘤的密切相关性，可以通过分析KRAS基因的变异情况(i)进行肿瘤的鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)早期评估相关人群肿瘤的患病风险，早期监测早期防治。可采用各种技术来检测KRAS基因变异位点，较为方便的是用KRAS基因突变型特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)，对KRAS基因进行扩增，对扩增产物进行序列测定，从而判断是否发生变异。该技术也可检测KRAS基因的转录产物。在检测KRAS基因变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物组合，选自下组：用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合：正向引物SEQ？ID？NO：3、SEQID？NO：4、SEQ？ID？NO：5、SEQ？ID？NO：6、SEQ？ID？NO：7、SEQ？ID？NO：8和反向引物SEQ？ID？NO：9；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合：正向引物SEQ？ID？NO：18和反向引物SEQ？ID？NO：12、SEQ？ID？NO：13、SEQ？ID？NO：14、SEQ？ID？NO：15、SEQID？NO：16、SEQ？ID？NO：17；或用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合：正向引物SEQ？ID？NO：19、SEQ？ID？NO：20、SEQ？ID？NO：21、SEQ？ID？NO：22、SEQ？ID？NO：23、SEQ？ID？NO：24和反向引物SEQ？ID？NO：25。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：