筛选核酸配体的方法技术

本发明专利技术提供就核酸配体筛选候选体库的方法，所述方法包括下列步骤：（a）制备核酸配体候选体库；（b）在靶物质缺失下使库与支持部接触，所述支持部与包括在配体中的保守的序列结构域中的至少一个结合，然后分离及移出不形成分子间双链体的配体；及（c）通过在靶物质存在下使靶物质接触步骤（b）中获得的余下形成分子间双链体的配体来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成的特定二级结构的配体，其中方法包括至少一次步骤（b）及至少一次步骤（c）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，且尤其涉及筛选对靶物质具有亲和性且与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体的方法。
技术介绍
适体是指与靶物质特异性结合的核酸配体。在1990年，Gold等人首先建议其基本概念。已知通过使用利用对靶物质的结合亲和力作为指标的称之为SELEX方法的方法选择及获得适体的方法。短语〃通过指数富集的配体的系统性进化(the Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 〃缩写为〃SELEX〃。直到现在，已公开广泛的分子作为适体的靶物质。报道的靶物质的例包括，例如，各种蛋白，酶，肽，抗体，受体，激素，氨基酸，抗生素和其他各种化合物。利用对靶物质的结合亲和力作为指标的SELEX方法已常改善对靶物质的亲和性和特异性，由此实现各种特定目的。此外，对于利用与靶物质结合后的结构变化作为指标的方法，美国专利申请No. 07/960, 093公开了，通过使用SELEX和凝胶电泳的组合选择具有特定结构性质的核酸(例如，弯曲的DNA)。而且，已知使用结构-切换信号传导适体中的适体的体外选择，由此旨在获得利用与靶物质结合后的结构变化的传感器的适体。作为利用经历与靶物质结合后的结构变化的核酸配体的传感器，使用，例如，荧光报告子的方法发现是特别有用的。关于以上使用荧光报告子的方法，已开发各种方法。报道的方法的例包括基于适体的单生色团报告子方法，适体信标(基于适体的双生色团报告子方法),解毒物(DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法，QDNA),原位标记方法，嵌合适体方法，及荧光染色方法。与靶物质结合后核酸配体的结构变化提供影响传感器的SNR (信号-噪音比)或检测限的重要功能。强烈期望的是开发精确地调控结构变化的技术和获得结合靶物质导致结构变化的配体的简单，系统性和稳健的技术。引用文献专利文献PTL I :美国专利申请 No. 07/960，09非专利文献NPL I Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 9, 1963-1968
技术实现思路
一般而言，获得核酸配体的方法，以SELEX方法为代表，旨在通过利用对靶物质的结合亲和力作为指标从核酸候选配体库选择对靶物质具有更高亲和性的核酸配体。以上公开于美国专利申请No. 07/960, 093的方法提供利用从与靶物质结合后的结构变化得到的物理性质变化的选择。此方法可有效获得作为全核酸配体-靶物质复合分子的经历结构变化的核酸配体。但是，无法指明核酸序列的哪个部分经历与靶物质结合后的结构变化和/或哪个部分形成二级结构。该方法不利用与靶物质结合后特定特异性预设计的核酸序列之间的双链体形成作为结构变化的指标。在结构-切换信号传导适体的适体的体外选择中，通过利用对靶物质的结合亲和力和与靶物质结合后的结构变化的能力二者作为指标开发了在DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法(基于适体的双生色团报告子方法)中使用的传感器，通过选择能经历结构变化的适体获得的传感器。此方法预先加工多个结构域作为核酸候选配体库的保守的序列结构域。但是，各保守的序列结构域不提供互补序列，且不具有在保守的序列结构域之间形成分子内双链体的功能。此外，保守的序列结构域包括多个引物结合结构域(PBD)和中心-固定的序列基序。相比使用共同序列的稳健的和系统性(合理的)方法，在DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法中使用的此适体传感器是获得具有结构变化的能力而保持对靶物质的亲和性的标记的适体分子的方法。特别是，2种标记的-寡DNA (FDNA, QDNA)分别互补于中心-固定的序列基序及保守的引物结合结构域之一而形成双链体。接下来，FDNA和QDNA之间的距离在由与靶物质结合所致的结构变化后变化，或所述距离在FDNA解离后变化，然后检测靶物质。但是，此方法在与靶物质结合之后不调控结构变化(双链体形成)。此外，预测到，以上结构变化的程度不保持恒定，也被预测难以通过与靶物质结合调控FDNA的解离。因而，可不精确地调控FDNA和QDNA之间的距离。关于获得用于利用核酸配体中的结构变化的传感器的核酸配体(分子信标适体)序列的方法，通常使用的是如下方法，其包括由SELEX方法获得序列，然后通过再加工序列赋予结构变化的能力。例如，有对具有在与靶物质结合后经历结构变化(双链体形成)的能力的分子信标适体的报道。该方法可不赋予对靶物质的亲和性，由于序列在获得核酸配体后被再加工，以给序列赋予结构变化的能力。或者，注意到，造成依赖于相应序列的再加工的必要。由此，当前情况表明，以上方法不可认为是稳健的方法，因为需要对于获得的各核酸配体重复优化加工。此外，有通过作为解毒剂添加互补于由SELEX方法获得的核酸配体序列的序列来调控结构变化的感觉方法。但是，对靶物质的亲和性可变化，且个体配体也需要优化加工(例如，序列，序列长度，错配的插入，序列位置)。S卩，尚不存在通过利用核酸配体候选体库对靶物质的结合亲和力和在与靶物质结合后在已设计为保守的序列结构域的多个互补序列之中形成分子内双链体的结构变化的能力二者作为指标就核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。为解决用以上-提及的常规技术的问题而密集研究的结果，本专利技术人发现，通过利用对靶物质的结合亲和力和结构变化能力二者作为指标。本专利技术的是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。所述方法包括下列步骤(a)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b)在靶物质缺失下使候选配体库接触支持部，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及去除不形成分子间双链体的核酸配体 ’及(C)通过在靶物质存在下使靶物质接触步骤(b)中获得的余下形成分子间双链体的核酸配体来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成、的特定二级结构的核酸配体，其中方法包括至少一次步骤(b)及至少一次步骤(C)。此外，另一本专利技术的是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。所述方法包括下列步骤(a’)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b’ )在靶物质存在下使候选配体库与支持部接触，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及收集不形成分子间双链体的核酸配体 ’及U，)自步骤(b’)中分离的及收集的核酸配体去除靶物质；及((1’)在靶物质缺失下使支持部与步骤(c’)中获得的去除靶物质的核酸配体接触，然后分离及收集在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的核酸配体。专利技术效果本专利技术可提供有效和系统性筛选对靶物质具有亲和性及与以上靶物质结合之后在保守的序列结构域中在彼此互补的多个预设计的序列之中形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：畠山哲，伊比井崇向，
申请(专利权)人：佳能株式会社，
类型：发明
国别省市：