BRAF基因突变检测引物探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种BRAF基因突变检测引物探针及其试剂盒，试剂盒包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；引物探针混合液中包括用于检测第463密码子G463V位点的上下游引物A和突变探针A，用于检测第465密码子G465E位点的上下游引物B和突变探针B，用于检测第468密码子G468A位点的上下游引物C和突变探针C，以及用于检测第600密码子V600E位点的上下游引物D和突变探针D。本发明专利技术的BRAF基因突变检测试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行多重PCR检测。

Primer probe for detecting BRAF gene mutation and kit thereof

The invention relates to a method for the detection of BRAF gene mutation primer probe and kit kit, including mixing liquid, liquid droplets stabilizer and primer probe mixture used for digital PCR digital pre mixed PCR reaction liquid; mixture including primer probe for detecting primers of A codon 463rd mutation loci of G463V and A for probe. Detection of primers of B codon 465th mutation loci of G465E and B probe, for the detection of codon 468th G468A loci primers C and C probe for the detection of mutations, and codon 600th V600E loci primers D and D mutant probe. The BRAF gene mutation detection kit has high sensitivity and specificity and small sample requirement, and can carry out multiplex PCR detection quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
BRAF基因突变检测引物探针及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测BRAF基因突变的引物、探针和检测产品，属于生物

技术介绍
BRAF通过激活MAKP通路和抑制促凋亡因子BIM，导致细胞异常增殖和分化,BRAF错义突变发生于近8％人类肿瘤中，主要发生于结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中。BRAF基因突变主要有两种类型：外显子11上的甘氨酸环突变，如G463、G465、G468等点突变；外显子15激活区的突变发生，T1799A位点突变，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代。鉴于BRAF突变基因在人类肿瘤中出现的高频率，事先对肿瘤患者检测是否具有BRAF基因突变，再选择适合的MERK1/2抑制剂治疗，对肿瘤患者的治疗可能会取得更满意的治疗结果。探索患者BRAF耐药机制及预测预后成为一条可行的途径，现在已经明确肿瘤细胞会释放DNA进入循环系统，使得通过“液态活检”的方式，能够对早期及晚期肿瘤患者特定的核酸序列进行分析，是一种非侵入性的检测肿瘤基因及临床治疗效果的一种方法，而且患者对非侵入性样本采集方式的接受度更高。但是由于大多数人血清/血浆中cfDNA含量低，在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01％，且cfDNA片段相对小等原因，目前对肿瘤相关基因的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。因此，ctDNA的检测就需要一种比常规方法更灵敏更特异的技术。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。数字PCR技术在单分子扩增后对样品DNA精确定量，具有比其他PCR更高的测量精度。数字PCR的灵敏度主要取决于2个主要的方面：样品中核酸提取的效率和具体检测体系的灵敏度，两者一起决定了目标序列的检测灵敏度。微滴式数字PCR检测极低拷贝数样本时其检测结果不稳定，需要多次平行实验。由于硬件设备的限制，很难很难实现多个位点的同时检测，并且dPCR多重检测体系受限于PCR扩增产物的长度，对TaqMan探针的设计有着非常高的要求。本专利技术从数字PCR检测体系改进，提高数字PCR检测的稳定性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行多重PCR检测的BRAF基因突变检测引物探针及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种BRAF基因突变检测引物探针，包括用于检测第463密码子G463V位点的上下游引物A和突变探针A，用于检测第465密码子G465E位点的上下游引物B和突变探针B，用于检测第468密码子G468A位点的上下游引物C和突变探针C，以及用于检测第600密码子V600E位点的上下游引物D和突变探针D；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述探针C的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述上游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述下游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述探针D的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。上述探针A、B、C、D进行了LNA修饰。上述上下游引物A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L，探针A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.15～0.30μM/L。上述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.18μM/L，所述上下游引物D在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L所述探针A、B、C、D在反应体系中的最终浓度分别为0.22μM/L、0.19μM/L、0.21μM/L、0.18μM/L。上述探针A、B、C、D的5’端设有报告荧光基团，3’端设有淬灭荧光基团。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的引物探针的BRAF基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种BRAF基因突变检测试剂盒，包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第463密码子G463V位点的上下游引物A和突变探针A，用于检测第465密码子G465E位点的上下游引物B和突变探针B，用于检测第468密码子G468A位点的上下游引物C和突变探针C，以及用于检测第600密码子V600E位点的上下游引物D和突变探针D；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述探针C的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述上游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述下游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述探针D的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。上述探针A、B、C、D进行了LNA修饰；所述上下游引物A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L，探针A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.15～0.30μM/L；所述探针A、B、C、D的5’端设有报告荧光基团，3’端设有淬灭荧光基团。上述BRAF基因突变检测试剂盒还包括组蛋白脱乙酰化酶溶液,所述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX和缓冲液；所述液滴稳定剂中包括矿物油。上述BRAF基因突变检测试剂盒反应时，反应体系中包括数字PCR预混液10体积，引物探针混合液2体积，液滴稳定剂2体积，模板1体积，灭菌超纯水5体积，所述模板的使用浓度为0.1ng/ul～1ng/ul。本专利技术具有积极的效果：1)本专利技术的BRAF基因突变检测试剂盒与常规多重引物设计原则不同，本专利技术的产物长度和引物长度较短，并对引物和探针进行特殊的修饰，提高了针对突变位点和野生型位点各自探针的特异性，达到探针和靶序列特异性结合的目的，对检测体系优化，使得本专利技术的灵敏度为0.01％，特异性为100％，能够对更低突变丰度的样本进行检测。2)本专利技术的BRAF基因突变检测试剂盒除具有超高灵敏度外，还可进行多重PCR分析。通过设计探针的荧光信号和调节探针浓度达到4重检测，由原来的1个芯片检测1个BRAF突变样本变为1个芯片检测4个BRAF突变样本，检测成本节约5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：包括用于检测第463密码子G463V位点的上下游引物A和突变探针A，用于检测第465密码子G465E位点的上下游引物B和突变探针B，用于检测第468密码子G468A 位点的上下游引物C和突变探针C，以及用于检测第600密码子V600E 位点的上下游引物D和突变探针D；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述上游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探针C的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述上游引物D的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述下游引物D的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述探针D的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

【技术特征摘要】
1.一种BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：包括用于检测第463密码子G463V位点的上下游引物A和突变探针A，用于检测第465密码子G465E位点的上下游引物B和突变探针B，用于检测第468密码子G468A位点的上下游引物C和突变探针C，以及用于检测第600密码子V600E位点的上下游引物D和突变探针D；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述上游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述下游引物C的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，所述探针C的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述上游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述下游引物D的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，所述探针D的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。2.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：所述探针A、B、C、D进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：所述上下游引物A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L，探针A、B、C、D在反应体系中的最终浓度均为0.15～0.30μM/L。4.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：所述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L，所述上下游引物C在反应体系中的最终浓度为0.18μM/L，所述上下游引物D在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L所述探针A、B、C、D在反应体系中的最终浓度分别为0.22μM/L、0.19μM/L、0.21μM/L、0.18μM/L。5.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测引物探针，其特征在于：所述探针A、B、C、D的5’端设有报告荧光基团，3’端设有淬灭荧光基团。6.一种采用如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，赵会，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31