用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。本发明专利技术首先以松材线虫种内保守的SYG‑2基因为靶基因，设计并筛选获得一组对松材线虫特异性高的LAMP引物组，该LAMP引物组能够特异性区分松材线虫和拟松材线虫。本发明专利技术利用所述LAMP引物组建立了一种松材线虫LAMP快速检测试剂盒。本发明专利技术进一步利用所述LAMP引物组建立了一种松材线虫的LAMP快速检测方法，该方法能够准确鉴别样品中是否携带有松材线虫。本发明专利技术所述LAMP检测方法特异性高，操作简便、耗时短，对于松墨天牛携带松材线虫的快速检测以及松材线虫病的总体预警与控制策略具有重要意义。

LAMP primer set, reagent kit and detection method for detecting pine wood nematode

The invention discloses a LAMP primer set, a reagent box and a detection method for detecting pine wood nematode. The invention firstly by SYG conservative within species of pine wood nematode 2 gene as the target gene, and screened a group of design of pine wood nematode high specificity LAMP primer pairs LAMP primers specific to the group between Bursaphelenchus xylophilus and b.. The invention utilizes the LAMP primer set to establish a LAMP fast detection kit for pine wood nematode. The invention further utilizes the LAMP primer set to establish a rapid LAMP detection method for pine wood nematode, which can accurately identify whether or not a pine wood nematode is carried in the sample. The LAMP detection method of the invention has high specificity, simple operation and short time consuming, and is of great significance for the rapid detection of pine wood beetle carrying pine wood nematode and the overall pre-warning and control strategy of the pine wood nematode disease.

【技术实现步骤摘要】
用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及松材线虫的分子检测，尤其涉及用于检测松墨天牛携带松材线虫的LAMP引物组和试剂盒，还涉及所述LAMP引物组、试剂盒在检测松墨天牛携带松材线虫中的应用，属于松墨天牛携带松材线虫的分子检测领域。
技术介绍
松材线虫病(Pinewiltdisease)，又被称为松树萎蔫病、枯萎病，该病由松材线虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]引起，主要通过墨天牛属(Monochamus)昆虫在松树上取食和产卵进行自然传播以及病木、病木加工木的运输进行长距离传播。林区内松材线虫的传播主要靠松墨天牛，可为害包括松属(Pinusspp.)、落叶松属(Larixspp.)、云杉属(Piceaspp.)、黄杉属(Pseudotsugaspp.)、冷杉属(Abiesspp.)和雪松属(Cedrusspp.)的36种松属植物和8种非松属植物，其中松属植物是最主要的寄主。由于其危害极其严重而目前又缺乏有效的防治方法，被多个国家列为头号检疫对象。形态学是线虫种类常规鉴定的标准方法，松材线虫的鉴定主要依靠成虫的形态特征。但是，通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定。由于形态学的限制，免疫学、生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上。松墨天牛是松材线虫病最重要的传播媒介，携带的是松材线虫幼虫，且携带的线虫有多种，难以根据形态学特征来区分和鉴定松材线虫幼虫。准确诊断松墨天牛携带的松材线虫是监测松材线虫病发生蔓延过程中急需解决的难题。分子生物学技术的引入，克服了形态学的一些限制，实现快速鉴定。松墨天牛携带的松材线虫分子检测技术的开发，对于及时发现早期疫点，有效的将松材线虫病控制在一定的范围内，缩小松材线虫病的发生，降低防治成本，具有重要的意义；同时为松材线虫病的总体预警与控制策略提供依据。目前，松材线虫的检测与鉴定主要以分子生物学的方法为主。其中，DNA探针技术虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，具有放射性；RAPD技术分析松材线虫与近似种的关系，结果重复性较差；RFLP技术区分松材线虫和拟松材线虫，内切酶价格昂贵、耗时；荧光PCR灵敏、快速，但较昂贵；PCR技术操作简便、花费较少，但所需时间也较长。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP)是2000年日本荣研化学株式会的NotomiT等开发的一种新的核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6个区域设计了2对特异的引物，引物在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下在恒温条件(65℃左右)下保温几十分钟，因其独特的反转设计，对自身进行链置换无限扩增；整个反应过程1个小时内即可完成，其间不需要模板的热变性、退火、温度循环等过程，扩增具有高特异性、等温快速的特点。因此，相较以上几种分子检测技术，LAMP扩增不需要昂贵的仪器和试剂，更利于在一些基层机构的应用。SYG-2基因是编码多功能细胞粘附因子的基因。SYG-1和SYG-2存在于所有动物类群中，从突触的形成到过滤防御屏障的建立，参与多种主要的生理功能。以松材线虫的SYG-2基因为靶标设计特异性引物，对松墨天牛携带的松材线虫进行LAMP快速扩增，将对于松材线虫的快速鉴定及有效防控具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供用于检测松材线虫的LAMP引物组；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种松材线虫的LAMP检测试剂盒；本专利技术所要解决的第三个技术问题是建立一种松材线虫的LAMP快速检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了用于检测松材线虫的LAMP引物组，所述LAMP引物组选自以下2组引物中的任意一组：引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成；引物组(2)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示上游环引物和SEQIDNo.6所示下游环引物组成。优选的，所述检测样品是松墨天牛。本专利技术经NCBI比对松材线虫和拟松材线虫的SYG-2基因片段，发现该段基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极其大。因此，本专利技术以松材线虫的SYG-2基因为靶基因，设计了16组LAMP引物。对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果证明，16号引物组不加环引物(即本专利技术所述引物组(1))，扩增不出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性好；而且16号引物组不加环引物，检测松材线虫Bx的出峰时间为25-30min，扩增效率较高。16号引物组在加环引物的情况下(即本专利技术所述引物组(2))，可以扩增出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性不好。本专利技术所设计的8号引物组在不加环引物的情况下，也扩增不出拟松材线虫，其检测松材线虫Bx的出峰时间为15-20min，扩增效率略优于16号引物组不加环引物。虽然4号引物组加环引物或者不加环引物，都不能扩增出拟松材线虫，但其扩增效率不是最优；具体为，4号引物组加环引物检测松材线虫Bx的出峰时间为20-25min；4号引物组不加环引物检测松材线虫Bx的出峰时间为30-35min。比较可见，在不加环引物的情况下，16号引物组的扩增效率优于4号引物组。另外，本专利技术所设计的1号、10号、13号和15号引物组加/不加环引物都能扩增出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性差；3号和5号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，均扩增不出松材线虫和拟松材线虫；其余7组引物加/不加环引物均不能扩增出松材线虫；可见，上述引物组均不能用于松墨天牛携带松材线虫的检测。因此，本专利技术用于检测松墨天牛携带松材线虫的LAMP引物组优选为16号引物组不加环引物，即引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成。本专利技术所述的LAMP引物组能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。本专利技术进一步公开了一种松墨天牛携带松材线虫的LAMP检测试剂盒，包括：LAMP引物组，2×RM(包括：Tris-HCl，KCl，MgSO4，(NH4)SO4，Tween20，Betaine，dNTPs)，SYBRGreenⅠ，BstDNA聚合酶和ddH2O；其中，所述LAMP引物组选自本专利技术所述的LAMP引物组，即16号引物组加环引物或者不加环引物，优选为16号引物组不加环引物。本专利技术所述的LAMP检测试剂盒能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。本专利技术还公开了一种松墨本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组选自以下2组引物中的任意一组：引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQ ID No.4所示下游内引物组成；引物组(2)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQ ID No.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游环引物和SEQ ID No.6所示下游环引物组成。

【技术特征摘要】
1.用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组选自以下2组引物中的任意一组：引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成；引物组(2)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示上游环引物和SEQIDNo.6所示下游环引物组成。2.按照权利要求1所述的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组为引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示上游外引物和SEQIDNo.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示上游内引物和SEQIDNo.4所示下游内引物组成。3.权利要求1或2所述的LAMP引物组在检测样品中是否携带松材线虫中的应用；优选的，所述检测样品是松墨天牛。4.一种松材线虫的LAMP检测试剂盒，包括：LAMP引物组，2×RM，SYBRGreenⅠ，BstDNA聚合酶和ddH2O；其特征在于：所述LAMP引物组选自权利要求1或2所述的LAMP引物组。5.按照权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP引物组为权利要求2所述的LAMP引物组。6.权利要求4或5所述的LAMP检测试剂盒在检测样品中是否携带松材线虫中的应用；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪来发，王曦茁，朴春根，李永，林彩丽，薛寒，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11