一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用，本发明专利技术针对14种高危型HPV设计的引物和探针，可特异性的实现快速对HPV E6/E7 mRNA的检测与鉴别。本发明专利技术的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技术和分子信标熔解曲线技术的人乳头瘤病毒E6/E7基因检测技术。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮性病毒。它对表皮和粘膜鳞状上皮具有特殊嗜性，为无包膜的双链环状DNA病毒，具有高度的特异性，且在人和动物中分布广泛。HPV基因组共由3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(LateRegion，L区)和与非编码区(UncodingRegion，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有HPV基因组DNA的复制起点和调控HPV病毒的转录与复制表达所必需的元件。人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)经过完全测序后可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，甚至可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型和“高危”型，前者主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)；后者的感染是引发宫颈癌的主要致病因素。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。研究发现，中国妇女HPV感染率的年龄组分布曲线呈现出两个高峰(20-24岁和40-44岁)，HPV的感染正日益普遍的影响着中国妇女的生活质量和身心健康。宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV的感染使得宫颈癌的相对危险性增加了250倍，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。事实上，约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。临床上HPV分型检测是应用分子生物学的方法检测病毒的核酸，主要集中在以靶序列扩增为基础的检测技术(如荧光-PCR法)和以信号放大为基础的检测技术(如杂交捕获法)。国内市场上HPV核酸检测试剂盒检测的靶序列主要针对HPV的L1基因序列和全基因组序列，这些方法是以病毒基因组DNA作为靶序列，检测样本载有的病毒类型及负荷量。实际上宫颈细胞的病变程度不仅与病毒类型以及负荷量相关，也与致癌基因的活动程度密切相关。HPVE6/E7信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)是病毒癌基因的转录产物，它在宫颈组织中表现出癌基因的活性，HPVE6/E7mRNA水平与病变的严重程度相关。研究表明，与HPVDNA检测相比，HPVE6/E7mRNA检测可能是一种更有效的方式，为感染高危型HPV的妇女提供了更准确的风险预测。2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPVE6/E7mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一进行研究。而随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合，基于核酸扩增的技术也得到了快速的发展。如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是一种检测RNA的简便、准确的常规技术。但是，基于PCR的技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，且灵敏度仍有待提高。接着无需电泳分析的实时荧光RT-PCR成为更快捷的一种核酸扩增和RNA检测技术。该技术利用荧光探针实现对靶核酸的特异性检测，利用荧光信号的积累实现实时监测PCR扩增反应的全过程从而能实时分析检测结果。由于实时荧光RT-PCR仍需要有反转录步骤和变性、退火及延伸等三个温度点进行几十次升降温循环，每个温度点和时间也需精确设定，整个反应仍需耗时2-2.5小时以上。近年来，一种新型的核酸扩增技术—等温扩增技术实现在恒温条件下的检测。如DNA环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplificationofDNA，LAMP)应用的比较广泛，也有相关专利申请，但LAMP技术需要使用4条引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，虽然提高了特异性，但针对变异大的病毒核酸分子在设计上非常困难。而另一种快速等温扩增技术，核酸序列依赖性扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技术克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA的检测。与PCR的区别在于，NASBA是在AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶等三种酶的共同协作下，在41-42℃，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。其中一条引物其5’端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列。在NASBA基础上结合分子信标(molecularbeacon)探针可以建立实时NASBA等温扩增技术。该技术具有以下优点：(1)等温扩增：反应在同一恒温体系条件下进行；(2)快速高效、灵敏度高：实时NASBA反应是一种无需升降温的连续快速扩增，也不需要反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在60-90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增109倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA，比常规PCR方法更加敏感；(3)特异性高、实时检测：反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针的检测进一步提高了特异性和灵敏度，也实现了实时检测和结果分析；(4)设计简单：只需设计1对引物和1条探针来识别靶RNA的一段区域内序列，对于检测变异度高的病毒核酸来说，设计上相对LAMP技术更为容易。高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。HRM技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在基因未知突变以及SNP的扫描、已知突变及SNP的基因分型、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定、法医鉴定、亲子鉴定、HLA的配型和甲基化的研究等方面。HRM技术的主要原理是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是，提供基于实时等温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，其特征在于，包括如下引物对和分子信标探针：(1)检测HPV16的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；(2)检测HPV18的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，检测HPV18的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；(3)检测HPV31的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，检测HPV31的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；(4)检测HPV33的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，检测HPV33的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；(5)检测HPV35的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14示，检测HPV35的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；(6)检测HPV39的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17示，检测HPV39的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；(7)检测HPV45的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20示，检测HPV45的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；(8)检测HPV51的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23示，检测HPV51的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；(9)检测HPV52的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25～26示，检测HPV52的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；(10)检测HPV56的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29示，检测HPV56的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；(11)检测HPV58的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31～32示，检测HPV58的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；(12)检测HPV59的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34～35示，检测HPV59的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；(13)检测HPV66的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37～38示，检测HPV66的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；(14)检测HPV68的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.40～41示，检测HPV68的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。...

【技术特征摘要】
1.一种基于实时等温扩增的用于人乳头瘤病毒E6/E7基因检测的引物及探针，其特征在于，包括如下引物对和分子信标探针：(1)检测HPV16的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示，检测HPV16的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)检测HPV18的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.4～5所示，检测HPV18的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(3)检测HPV31的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.7～8所示，检测HPV31的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；(4)检测HPV33的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.10～11所示，检测HPV33的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；(5)检测HPV35的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.13～14示，检测HPV35的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；(6)检测HPV39的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.16～17示，检测HPV39的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；(7)检测HPV45的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.19～20示，检测HPV45的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；(8)检测HPV51的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.22～23示，检测HPV51的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；(9)检测HPV52的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.25～26示，检测HPV52的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.27所示；(10)检测HPV56的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.28～29示，检测HPV56的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；(11)检测HPV58的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.31～32示，检测HPV58的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；(12)检测HPV59的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.34～35示，检测HPV59的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.36所示；(13)检测HPV66的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.37～38示，检测HPV66的分子信标探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.39所示；(14)检测HPV68的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.40～41示...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，吕江峰，潘彩霞，
申请(专利权)人：杭州迪安生物技术有限公司，杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33