一种基于聚合酶等温扩增技术检测重金属离子的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于磁性核‑壳纳米粒子和聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测重金属镍离子的方法，属于分析化学或环境监测技术领域。利用自组装技术，将DNA链S1通过Au‑S键固定到Fe3O4@Au核‑壳磁性纳米粒子表面。镍离子（Ni2+）存在时，核酸链S1在酶位点被Ni2+切割，核酸链S1的5′端的部分碱基缺失导致其3′端核酸链成为单链，继而与另一条互补序列的DNA单链S2发生杂交结合。当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对溶液中Ni2+的测定，该法具有高灵敏度、高选择性、简单、快速等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析化学或环境监测
，具体涉及一种基于磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测重金属镍离子的电化学方法。
技术介绍
镍是维持机体新陈代谢过程所必需的微量元素，其生物学作用极为广泛，但镍及其化合物又是常见的环境污染因子。镍广泛应用于电镀、汽车、电解、农药、医药、油漆等行业。镍可以通过大气吸入和饮食等多种途径进入人体，当体内积蓄过量时会造成鼻腔、肺和心脏等一系列疾病，甚至诱发癌症。因此，镍是环境、食品等介质中需要监控的重金属之一。目前，镍的常用测定方法有分光光度法、原子光谱法、电感耦合等离子体质谱法和荧光法等。这些方法不仅需要高精密度的仪器，对操作技术要求高，且检测周期长、检测成本高。因此，需要发展简单、快速，且可实现痕量检测镍的新方法和新技术。核酸等温扩增技术是近年发展起来的一种全新的核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。与常规PCR技术相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。核酸等温扩增技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，具有简单、快速、特异性强的特点，现已被广泛应用于各类核酸、病毒和微生物的检测。1994年，通过体外筛选技术得到脱氧核酶（DNAzyme）及其催化性能的发现，促进了核酸等温扩增技术的快速发展。脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一类具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA分子。与RNA相似，脱氧核酶可以形成复杂多样的折叠结构并显示出催化功能，可以催化DNA或RNA切割、DNA连接、DNA水解等多类反应。与传统蛋白酶相比，脱氧核酶具有稳定性高，相对分子质量小，易化学合成、修饰与复制，受酸度等环境因素影响小等优势。脱氧核酶非常容易进行以核酸为识别模式或者信号表达模式的生物传感器构建。此外，脱氧核酶具有对DNA进行连接与断裂的催化能力，可以应用到基因调控与治疗。磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型纳米材料，由于磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性、易清洗、易分离，以及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶固定化等领域的应用得到了广泛的发展。磁性纳米粒子的这些特性可以显著地提高生物传感器检测的灵敏度，缩短生化反应时间，提高检测通量，为生物传感器领域的应用开辟了广阔的前景。本专利技术基于磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应作为信号放大技术，利用Ni2+对DNA酶的RNA位点特异性切割和电化学方法，实现对重金属Ni2+的超痕量检测。为了增加分析速率和稳定性，磁纳米粒子表面发生聚合酶等温扩增反应形成的长链DNA复合物采用金磁电极吸附固定，该方法具有简单、快速、灵敏度高等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是设计不同序列的DNA，构建一种快速、灵敏的电化学传感器。本专利技术的目的之二是提供一种基于磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应放大技术联用构建电化学传感器的制备方法。本专利技术的目的之三是将构建的电化学传感器用于重金属离子的高灵敏、快速检测。本专利技术的具体技术方案如下：1.一种基于磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器首先制备Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子，将DNA核酸链S1通过Au-S键固定到Fe3O4@Au表面。Ni2+存在时，核酸链S1在rA位点被Ni2+切割为两段，导致其3′端核酸链成为单链，S1的3′端单链与另一条互补序列的DNA单链S2发生杂交结合。当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝（MB）嵌入到双链DNA空隙。形成的长链DNA复合物通过磁性富集在金磁电极表面实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对标准溶液或样品溶液中Ni2+浓度的定量测定。2.一种基于磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法（1）Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子的制备首先采用共沉淀法制备Fe3O4，将FeCl2、FeCl3和浓HCl溶于超纯水中，超声脱氧。将上述混合溶液滴加到NaOH溶液中，80℃搅拌下通N2气保护，得到Fe3O4磁性纳米粒子。在Fe3O4/乙醇溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，对Fe3O4粒子表面进行氨基化。在上述溶液中加入HAuCl4水溶液，以柠檬酸钠为还原剂，得到Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子。（2）双链DNA标记Fe3O4@Au粒子的制备将步骤（1）得到的Fe3O4@Au磁性纳米粒子与DNA核酸链S1在37℃下反应12h，孵化，磁分离，得到S1标记的Fe3O4@Au。将Ni2+与S1标记的Fe3O4@Au在37℃下孵化1h，核酸链S1在DNA酶位点被Ni2+切割为两段，核酸链S1的5′端的部分碱基缺失导致其3′端核酸链成为单链，之后于95℃加热5min，引发S2可与S13′端互补单链在37℃杂交3h形成双链DNA，得到双链DNA标记的Fe3O4@Au磁性纳米粒子。（3）聚合酶等温扩增反应在步骤（2）得到的双链DNA标记的Fe3O4@AuTris-HCl缓冲液中加入聚合酶和底物dNTP，37℃下杂交反应2h，得到长链DNA复合物。最后，DNA复合物与亚甲基蓝（MB）在37℃反应3h，将MB嵌入到Fe3O4@Au表面的双链DNA中。（4）Ni2+电化学传感器的制备将工作电极（金磁电极）在piranha溶液中浸泡1h，超纯水清洗。然后分别用0.3mm和0.05mm的Al2O3抛光粉打磨，依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗。最后在0.5MH2SO4溶液中，以50mV/s的扫速在-0.2~1.6V之间进行循环伏安扫描30圈，活化电极。N2气吹干备用。步骤（3）得到的长链DNA复合物通过磁性富集作用修饰到活化的金磁电极表面，构建重金属Ni2+电化学传感器。3.Ni2+离子的检测方法（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，修饰的金磁电极为工作电极，在10mMpH7.4的PBS缓冲溶液（包含20mMNaCl和0.1MNaClO4）中进行测试；（2）用微分脉冲伏安法（DPV）对重金属离子进行检测，设置扫描电位范围为0~1.2V，扫描速率为0.1V/S，记录峰电流的大小，并保存数据；（3）根据所得DPV峰电流的大小与Ni2+离子浓度的关系，绘制工作曲线；（4）采用标准加入法，在水样溶液中加入不同浓度的Ni2+离子标准溶液，按照工作曲线的绘制方法对不同浓度的Ni2+离子进行检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益成果：（1）本专利技术利用磁性纳米粒子和聚合酶等温扩增反应双重信号放大技术联用构建重金属离子电化学传感器。（2）本专利技术将Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子引入到电化学传感器的构建中，采用金磁电极，从而增加了修饰电极的稳定性。（3）本专利技术利用Ni2+对DNA酶特异性切割作用，设计特定序列的DNA，从而增强了电极对重金属离子的选择性，增加了传感器的特异性。（4）本专利技术制备的电化学传感器用于重金属Ni2+离子的检测，具有较高的选择性和抗干扰能力，线性范围宽，检测限低，可用于实际水样中超痕量Ni2+离子的测定。附图说明图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测金属离子的电化学方法，其特征是将含DNA酶且可部分自杂交的核酸链S1通过Au‑S键固定到金包裹的磁性纳米粒子表面；镍离子（Ni2+）存在时，核酸链S1的DNA酶位点被Ni2+切割，核酸链S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，互补序列DNA单链S2与S1单链部分杂交；当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大；根据电化学信号的增强实现溶液中的Ni2+浓度的测定，包括以下步骤：（1）Fe3O4@Au核‑壳磁性纳米粒子的制备首先采用共沉淀法在碱性条件下制备Fe3O4磁性纳米粒子，通过3‑氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行氨基化；之后利用柠檬酸钠还原HAuCl4×4H2O水溶液，在Fe3O4粒子表面形成金壳，得到Fe3O4@Au核‑壳磁性纳米粒子；（2）双链DNA标记Fe3O4@Au粒子的制备将Fe3O4@Au粒子与核酸链S1在37℃下反应12 h，孵化，磁分离，得到S1标记的Fe3O4@Au；将Ni2+与S1标记的Fe3O4@Au在37℃下孵化1 h，核酸链S1的DNA酶位点被Ni2+切割，S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，于95℃加热5 min，之后核酸链S2与S1单链部分于37℃杂交3 h形成双链DNA，得到双链DNA标记的Fe3O4@Au磁性纳米粒子；（3）聚合酶等温扩增反应双链DNA标记的Fe3O4@Au溶液中，于37℃下加入聚合酶和底物dNTP反应2 h，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后与亚甲基蓝MB在37℃反应3 h，使MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大；（4）分析检测使用电化学工作站进行电化学响应信号的检测，根据电化学响应信号的大小对标准溶液或样品溶液中Ni2+浓度进行定量测定。...

【技术特征摘要】
1.一种基于聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测金属离子的电化学方法，其特征是将含DNA酶且可部分自杂交的核酸链S1通过Au-S键固定到金包裹的磁性纳米粒子表面；镍离子（Ni2+）存在时，核酸链S1的DNA酶位点被Ni2+切割，核酸链S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，互补序列DNA单链S2与S1单链部分杂交；当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大；根据电化学信号的增强实现溶液中的Ni2+浓度的测定，包括以下步骤：（1）Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子的制备首先采用共沉淀法在碱性条件下制备Fe3O4磁性纳米粒子，通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行氨基化；之后利用柠檬酸钠还原HAuCl4×4H2O水溶液，在Fe3O4粒子表面形成金壳，得到Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子；（2）双链DNA标记Fe3O4@Au粒子的制备将Fe3O4@Au粒子与核酸链S1在37℃下反应12h，孵化，磁分离，得到S1标记的Fe3O4@Au；将Ni2+与S1标记的Fe3O4@Au在37℃下孵化1h，核酸链S1的DNA酶位点被Ni2+切割，S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，于95℃加热5min，之后核酸链S2与S1单链部分于37℃杂交3h形成双链DNA，得到双链DNA标记的Fe3O4@Au磁性纳米粒子；（3）聚合酶等温扩增反应双链DNA标记的Fe3O4@Au溶液中，于37℃下加入聚合酶和底物dNTP反应2h，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳丽，李海燕，庞鹏飞，王红斌，
申请(专利权)人：云南民族大学，
类型：发明
国别省市：云南;53