本发明专利技术公开了基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用，特点是根据苹果根结线虫的rDNA‑ITS、北方根结线虫的rDNA‑ITS、花生根结线虫的IGS2序列、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，建立等温扩增微流体芯片检测体系，完成苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫的检测，其中各引物序列如SEQ ID NO.1‑30所示，优点是检测物种数和样本数多、操作简单快捷，高灵敏度和特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及根结线虫的检测，尤其是涉及一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用。
技术介绍
根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中种类最多、分布最广、危害最严重的类群之一。目前，已经得到鉴定的在中国境内有分布主要有23种，其中以南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫等4种线虫分布较广；象耳豆根结线虫因其可克服Mi抗原基因的抗性且无法令穿刺巴氏杆菌寄生等生物学特性，颇具研究价值。而苹果根结线虫、山茶根结线虫为我国口岸检疫中截获的常见根结线虫(非中国种)。传统的根结线虫种类鉴定主要依据雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态学特征分析结合鉴别寄主测定等方法，然而根结线虫的形态特征常存在种内变异，对专业知识要求高，鉴别寄主鉴定又费时。随着分子生物学技术的发展，同工酶电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)、实时荧光定量PCR等技术应用到了根结线虫的检测与鉴定中。这些技术克服了线虫生长周期、寄主和地理来源等限制，在一定程度上增加了鉴定的准确性。然而，这些方法需配备PCR仪、凝胶成像系统等昂贵精密的仪器，易接触到溴化乙锭(EB)等致癌物，而且对于检测人员的专业知识要求较高。新发展起来的基于等温条件下的核酸扩增技术，以环介导等温扩增技术（LAMP）为典型代表，克服了热循环等造成的仪器的复杂程度，在微生物的即时快速检测中展示出一定的应用前景。尽管针对单一病原的快速检测技术得到了快速发展，病原的检测与鉴定越发变得快速和准确，但多病原的混合感染也已成为一种常态，多种病原针对同一宿主也可引起相似的症状或体征变化。而在进出口物品的检验检疫中，同一进出口商品也往往需要检测多种病原微生物。在此种情况下，这种同一检测手段的多次平行操作也在极大地限制着检测的时效和工效。因此，基于多样本或多病原同步检测的高通量方法称为当下检测类技术开发的重要领域。在此背景下发展起来的生物芯片技术，其具有的高通量、微型化，以及自动化等特点，完美地迎合了多样本、多病原检测的需求，极大地推动了检测技术的发展。目前生物芯片北京国家工程研究中心将微流体芯片技术和等温扩增技术联合应用，开发了等温扩增芯片检测控制系统，并已于2014年上市(如图1所示)。同时，设计完成了1款等温扩增芯片(碟式芯片)，1张芯片有24 个反应池，每个反应池的体积约1.4 μL，LAMP反应在芯片的反应池中完成，大幅度地减少了反应体系的体积，适合多项指标并行检测(如图1所示)。目前，该技术已成功应用于多重呼吸道病原菌、多重水产养殖病原微生物（细菌和病毒），以及多重食源性病原菌的同步检测，国内外还未见报道将该技术应用于根结线虫的检测与鉴定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测物种多，检测灵敏度和准确性高的基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列，根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2）、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，其中用于检测苹果根结线虫的引物序列是：Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；用于检测北方根结线虫的引物序列是：Mha-F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，Mha-B3：CGCTGCGTACCAACATTA，Mha-FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，Mha-BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，Mha-LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是：Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT，Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；用于检测爪哇根结线虫的引物序列是：Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，Mja-B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，Mja-FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，Mja-BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG，Mja-LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA，Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT；用于检测南方根结线虫的引物序列是：Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC，Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA，Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC，Min-BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT，Min-LF：CCCTGGTTTCAGGACCTATG，Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC。一种上述基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列的应用，具体检测步骤如下：1）碟式芯片的设计与点制将微流体碟式芯片由原来的单样本24个反应池改进为二样本22个反应池，芯片分I和II两个片区，每个片区11个反应池；在芯片点制过程中，首先将选好的苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫以及南方根结线虫的引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，以无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照；2) 配置反应体系反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，1´EvaGree本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列，其特征在于根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA‑ITS）、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA‑ITS）、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2）、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，其中用于检测苹果根结线虫的引物序列是：Mma‑F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，Mma‑B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，Mma‑FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，Mma‑BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，Mma‑LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，Mma‑LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；用于检测北方根结线虫的引物序列是：Mha‑F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，Mha‑B3：CGCTGCGTACCAACATTA，Mha‑FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，Mha‑BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，Mha‑LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，Mha‑LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是：Mar‑F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，Mar‑B3：AATGACAGCTGATAACATACT，Mar‑FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，Mar‑BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，Mar‑LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，Mar‑LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；用于检测爪哇根结线虫的引物序列是：Mja‑F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，Mja‑B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，Mja‑FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，Mja‑BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG，Mja‑LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA，Mja‑LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT；用于检测南方根结线虫的引物序列是：Min‑F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC，Min‑B3：ACGAACCGCGATATTTCAA，Min‑FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC，Min‑BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT，Min‑LF：CCCTGGTTTCAGGACCTATG，Min‑LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC。...
【技术特征摘要】
1.一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列，其特征在于根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2）、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，其中用于检测苹果根结线虫的引物序列是：Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；用于检测北方根结线虫的引物序列是：Mha-F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，Mha-B3：CGCTGCGTACCAACATTA，Mha-FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，Mha-BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，Mha-LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是：Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT，Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；用于检测爪哇根结线虫的引物序列是：Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，Mja-B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，Mja-FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，Mja-BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈炯，周前进，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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