基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法技术

本发明专利技术提供一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，首先提取小麦根际土壤样本总DNA作为PCR扩增的模板，然后以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物扩增获得129bp的特异性片段，经连接、转化后，再以qPCR扩增；本发明专利技术方法法不仅鉴定了丛枝菌根，并且可以准确的对其进行绝对定量，得到在转基因小麦各个生育期丛枝菌根真菌的拷贝数，在小麦生长发育阶段，丛枝菌根拷贝数的变化总体呈现逐渐增加的趋势，本发明专利技术建立了快速、简便而精确的鉴定方法，为后续试验提供了理论和试验依据，对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义，与现有方法相比，本发明专利技术方法敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法。
技术介绍
丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza, AM）真菌是一类备受关注的植物共生菌，它能与绝大部分农作物根系形成互惠共生体。AM真菌不仅能刺激植物对磷、氮等矿质元素的有效吸收，在增强植物的抗病、抗逆等方面也有积极的作用。近年来，转基因作物的大面积种植引发人们对环境问题的担忧，其中，转基因作物对土壤生态系统（微生物种类、种群、数量和生物多样性）的影响是目前备受关注的研究热点。因此在评价转基因植物的环境影响时，对土壤中的微生物尤其是具有重要指示作用微生物如丛枝菌根等进行监测是非常有必要的。目前常规的菌落数量研究通常采用平板菌落计数法，但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3个或更多细胞。且对于绝大部分微生物来说，目前为止还没有合适的离体培养方法，因此平板菌落计数法存在很大的局限性。而丛枝菌根真菌具有专性共生的性质，因此目前无法对其进行无菌纯培养，只能依赖活体植物进行繁殖，因此常规平板菌落计数法难以确切反映环境中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其特征在于，具体步骤如下：A）提取小麦根际土壤样本总DNA，溶于ddH2O中；B）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以小麦根际土壤样本总DNA为模板，进行PCR扩增，获得长度为129bp的特异性片段；C）对步骤B）获得的129bp特异性片段切胶回收，然后与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布于氨苄抗性平板，置于37℃环境中培养24小时，然后挑选单克隆于液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，所获得的阳性质粒即为目标质粒； D）以SEQ ID No.1和SE...

【技术特征摘要】
1.一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其特征在于，具体步骤如下：A）提取小麦根际土壤样本总DNA，溶于ddH2O中；B）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以小麦根际土壤样本总DNA为模板，进行PCR扩增，获得长度为129bp的特异性片段；C）对步骤B）获得的129bp特异性片段切胶回收，然后与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布于氨苄抗性平板，置于37℃环境中培养24小时，然后挑选单克隆于液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，所获得的阳性质粒即为目标质粒； D）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以目标质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增，根据标准曲线计算即可获得小麦根际土壤样本中丛枝菌根真菌的含菌量；所述标准曲线为Y=-3.327X+42.913，R2=0.99874，其中Y为荧光时实定量PCR反应的Ct...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴季荣，仇剑波，赵晶晶，邢宇俊，史建荣，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32