基于鱼的Shh基因监测水污染的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，用鱼作为检测水污染的生物样本，所述鱼的Shh基因作为水污染的敏感生物标记物；本发明专利技术的优点在于：Sonic hedgehog基因简称为Shh基因，在脊锥和无脊锥动物发育中有广泛生物学功能的信号分子，Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试Shh基因的相对表达量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感的表达出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测多环芳烃菲、重金属镉、多氯联苯污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水污染监测
更具体地说，本专利技术涉及一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法。
技术介绍
随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧，其中包括菲污染、重金属镉污染、多氯联苯污染等，其中镉是重金属污染的典型代表，多氯联苯153(PCB153)是多氯联苯异构体中的典型代表，菲是多环芳烃污染的典型代表。它们均是水生动物非必需但高致毒元素，具有亲脂强、易富集和难降解的特性，不仅能引起动物肾、肝、睾丸损伤，肺水肿和骨软化，而且与肾、肺、前列腺的癌变等相关，对环境、人和其他动物健康造成严重威胁。用化学方法可以定性、定量检测菲、镉、PCB153的污染，但是无法检测其危害性和危害程度，很难检测微量的菲、镉、PCB153污染。然而敏感生物标记物则可敏感地监测菲、镉、PCB153污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，通过鱼的Shh基因作为敏感生物标记物，测试并计算Shh基因的相对表达量，能敏感地预测水体污染的程度，方法简单，易操作，能快速灵敏地检测出水体污染程度，更好的监测水体污染，以便及时控制或治理污染。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法；本专利技术提供的技术方案为：一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，用鱼作为检测水污染的生物样本，所述鱼的Shh基因作为水污染的敏感生物标记物。优选的是，建立鱼的Shh基因的相对表达量2-△△Ct与污染浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的Shh基因的相对表达量2-△△Ct与标准曲线比对，获得污染浓度。优选的是，计算Shh基因的相对表达量具体包括以下步骤：1)用鱼作为监测水污染的生物样本；2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；3)实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述Shh基因的引物，所述18s-rRNA基因的引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系为：SYBR试剂12.5μL、上游引物F 1μL、下游引物R 1μL、cDNA 2μL、灭菌蒸馏水8.5μL，反应体系总体积为25μL；反应程序采用三步法程序：95℃预变性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40个循环；采集荧光信号数值Ct，Ct值是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；4)获得Shh基因荧光信号数值CtShh和内参基因荧光信号数值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法进行数据分析，△Ct＝CtShh-Ct18s-rRNA；△△Ct＝(CtShh-Ct18s-rRNA)实验组-(CtShh-Ct18s-rRNA)空白组，Shh基因的相对表达量＝2-△△Ct，计算2-△△Ct得出Shh基因的相对表达量。优选的是，所述鱼为仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他组为待测水域组；分别将仔鱼放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养；7天后随机抽取鱼样品，检测并计算Shh相对表达量2-△△Ct，如果待测水域组的2-△△Ct值小于无污染对照组的2-△△Ct值，则待测水域受到污染，其污染源的浓度与待测水域组的2-△△Ct值成负相关。优选的是，所述Shh基因的特异性引物为：上游引物如SEQ ID NO.1所示：Shh-F：5′-TGGCGGATCTCGGTGATGAAC-3′，下游引物如SEQ ID NO.2所示：Shh-R：5’-CGTACTTGCTCTTGTCCCTGTCT-3’；所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：上游引物如SEQ ID NO.3所示：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，下游引物如SEQ ID NO.4所示：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’。优选的是，所述水污染为多环芳烃污染，重金属镉污染，多氯联苯污染中的一种。优选的是，多环芳烃污染为菲污染。优选的是，所述鱼的Shh基因的相对表达量与所述菲，重金属镉，多氯联苯中的一种的浓度呈负相关。优选的是，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。优选的是，所述仔鱼为10天龄仔鱼。本专利技术至少包括以下有益效果：1)Sonic hedgehog基因简称为Shh基因，在脊锥和无脊锥动物发育中有广泛生物学功能的信号分子，Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试Shh基因的相对表达量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感的检出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测菲、重金属镉、多氯联苯污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。2)由于各实验组提取的样品重量不同；RNA提取效率不同；目的基因的扩增效率不同，所以Shh基因的荧光信号不能直接作为各实验组基因表达量的数据来进行比较，必须用内参基因进行校正，进行相对表达量的分析。18s-rRNA基因是维持细胞基本代谢活动所必需的基因，所以18s-rRNA基因作为内参基因，能更准确表述Shh基因的相对表达量。3)Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物，Shh相对表达量能敏感的表述出至少与多环芳烃，重金属镉，多氯联苯中的一种的浓度呈负相关，能监测多种污染源，而不仅限于单一污染源，能更大范围的监测水污染。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式结合下面实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例11、水污染鱼生物样本饲养准备采用10天龄仔鱼做监测水污染的实验，将仔鱼分成10组，每组3个平行进行养鱼实验，分别在表1所述的镉浓度水域环境中饲养，7天后，每个平行随机取3个鱼样品测定，每组测定3*3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后，得到各组鱼的Shh基因的相对表达量2-△△Ct，如表5所示。表1 10组幼鱼饲养的水域的镉浓度实验序号对照组123456789镉浓度(μg/L)0801602403204004805606407202、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；(1)快速称取冷冻的幼鱼100mg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研钵中倒入液氮，用研杵研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不锈钢小药匙迅速将样品粉末全部移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。(2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离心管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗涤匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离心管中，重复上述操作一次，使加入的RNAiso试剂总体积为1mL。盖好离心管并颠倒混匀数次后室温静置5min。(3)用1000μL微量移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，用鱼作为监测水污染的生物样本，鱼的Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物。

【技术特征摘要】
1.一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，用鱼作为监测水污染的生物样本，鱼的Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物。2.根据权利要求1所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，建立鱼的Shh基因的相对表达量2-ΔΔCt与污染浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的Shh基因的相对表达量2-ΔΔCt与标准曲线比对，获得污染浓度。3.根据权利要求2所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，计算Shh基因的相对表达量具体包括以下步骤：1)用鱼作为监测水污染的生物样本；2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；3)实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述Shh基因的引物，18s-rRNA基因的引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系为：SYBR试剂12.5μL、上游引物F 1μL、下游引物R 1μL、cDNA 2μL、灭菌蒸馏水8.5μL，反应体系总体积为25μL；反应程序采用三步法程序：95℃预变性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40个循环；采集荧光信号数值Ct，Ct值是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；4)获得Shh基因荧光信号数值CtShh和内参基因荧光信号数值Ct18s-rRNA后，采取2-ΔΔCt法进行数据分析，ΔCt＝CtShh-Ct18s-rRNA；ΔΔCt＝(CtShh-Ct18s-rRNA)实验组-(CtShh-Ct18s-rRNA)空白组，Shh基因的相对表达量＝2-ΔΔCt，计算2-ΔΔCt得出Shh基因的相对表达量。4.根据权利要求3所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：许友卿，丁兆坤，刘永强，刘富娟，计沈斌，梅婕，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45