从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用制造方法及图纸

本申请涉及从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用。一种制备分子阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子样品的空间排布，所述方法包括为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域分离的空间受限的有效区域、位于有效区域边界上的载体的具有结合接头或结合性质的表面。通过有效区域内的扩增剂扩增所述分子用于产生所述样品的复制物或衍生物。通过结合接头或结合性质使所述样品的复制物或衍生物结合至载体，从而使所述载体上样品的复制物和衍生物的空间排布对应于阵列中样品的空间排布。从所述阵列除去包含样品拷贝的载体。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2010年3月5日的题为“从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用”的中国专利申请No.201080019880.7的分案申请。
本专利技术涉及从分子阵列例如生物分子或化学方法制备的分子制备复制物或衍生物的方法，特别是涉及适合用于制备所述分子的微阵列的复制物或衍生物和/或从其衍生的分子，例如DNA微阵列、RNA微阵列或蛋白质微阵列的此类方法和装置，还涉及所述阵列用于鉴定与涉及一级序列的反应相关的DNA序列、其拷贝或其衍生物的应用。
技术介绍
微阵列可理解为表示许多不同的生物分子在单个点的表面上或表面内的排布。所述点还被称作斑点并且通常具有10μm-约1000μm的直径。一个斑点内存在一个或数个相同的生物分子群。但是除了一些有目的的冗余之外，各种斑点表示不同的生物分子。生物分子可沉积在表面，可存在于表面上的层内，可存在于腔室内，或者以固定化方式存在于颗粒上或颗粒内，有可能将所述颗粒排布成阵列。按照常规，有许多制备微阵列的方法。根据一项技术，例如使用光合成、化学合成、斑点合成、印刷法(printing process)等直接在表面合成生物分子(原位合成)。例如Affymetrix应用此类光合成技术，Agilent可进行斑点合成。Combimatrix通过真实的可电寻址的反应室制备DNA微阵列。根据另一项技术，首先合成(生物)分子，然后以排布的阵列沉积到表面上，此类技术被例如Agilent、Gesim和Biofluidix使用。两种技术均需要高额的技术费用。所述技术费用随着不同生物分子数量的增加和沉积斑点直径的减小而高于线性程度地增加。另外，当此类微阵列预包含例如两倍的物质，或者如果预减小包被结构即斑点的尺寸，所需要的时间和花费会显著增加。用于制备微阵列的印章技术(stamping technique)记载于[1]。通过在阵列上原位合成有可能制备数百万不同的DNA序列。但是，为了实现新的布局或者不同的谱型尺寸(图案尺寸，pattern size)，就必须重新组织整个生产过程。这将需要新的仪器设置并且在光辅助合成中甚至需要新的光刻掩膜或者重新设置数字镜像系统的程序，参见[2]，其中记载了利用数字镜像产生微阵列。应尽可能避免这一情况以降低成本。仅由于时间的限制就不可能通过在实验室内合成并且随后例如通过纳米点样仪转移至微阵列而转移数万种物质。需要花费数周或数月的时间用上百万不同的生物分子才可在微阵列上制备可评估数量的斑点。在这一时间内表面化学将会改变并且整个微阵列不再有效。因此，需要一种方法使得有可能以简单并且不昂贵的方式拷贝已有的微阵列，即复杂并且制备成本昂贵的已知生物分子的常规排布。已提出了与该问题相关的一些基本观点，[3]和[4]。[3]和[4]公开了复制寡聚核苷酸阵列的方法，其中将一种或多种生物素-功能化的寡聚核苷酸与一种或多种寡聚核苷酸杂交并且在第一基片(衬底，substrate)上扩增。然后用链霉亲和素将生物素功能化的并且扩增的寡聚核苷酸锚定至第二基片。可通过机械力将生物素功能化的寡聚核苷酸与所述寡聚核苷酸分离从而产生复制的阵列。但是，此类拷贝方法昂贵并且需要另外的生物化学锚定系统并且在许多情况下仅能够制备原始DNA阵列的负拷贝。[5]还记载了通过使用链霉亲和素/生物素系统拷贝DNA阵列。[6]记载了如何将DNA拷贝到RNA中。约30年以来，一直在实验室内扩增DNA。特别是聚合酶链式反应(PCR)几乎成为所有实验室的标准技术并且是大多数遗传学研究的基础。但是，还有其他技术能够扩增DNA，例如NASBA、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增和各种其他等温扩增技术。所述技术不仅能够扩增DNA而且还能够实现单个DNA区域或DNA子集的靶向扩增。通过特定地选择起点(引物)，还可以特异扩增单个DNA区。大多数DNA扩增过程发生在溶液中并且将其称作液相反应。但是，近几年内出现了数种利用另外的固相进行DNA扩增并且在该过程中在所述固相上富集所扩增DNA的方法。例如在玻片或固相上进行的引物延伸反应[9,10]。下文描述了两种最常用的方法，即DNA桥式扩增和油包水乳液扩增PCR的依据。DNA桥式扩增：对于桥式扩增，首先用已知的所谓接头序列在两端延伸(部分已知的)DNA。所述延伸物充当表面上的互补序列的结合位点。只有结合至表面之后才会出现扩增。然后将已拷贝的并且因此是新产生的DNA链固定(共价)结合至表面并且在其非结合末端具有另一个结合位点。所述另一结合位点还可结合至表面上的适合的对应物并且起始另一扩增，其进而产生结合在一个末端的新DNA链并且在另一游离末端具有原始结合序列。在该方法中，能够以指数方式产生越来越多的新链，它们在一个末端被固定结合，它们的另一末端使能够与表面暂时结合。在扩增过程中，原始链的一端被固定(共价)结合，另一端松散(非共价)结合，因此形成分子桥。就这一方面而言，[11]一般性记载了桥式扩增，[12]记载了利用桥式扩增进行测序。对于油包水乳液PCR，使用一种类型的桥式扩增。与桥式扩增相似，其涉及首先通过接头序列在两边延伸DNA链。然后将延伸的DNA与水性PCR混合物和固相颗粒-也称作珠粒-混合并且在油中乳化，从而得到油包水和颗粒的乳液。对于该油包水乳液，选择浓度使得理想地每一滴水中精确地包裹一条DNA链和一个颗粒。根据桥式扩增，颗粒表面包含使DNA拷贝能够与其共价结合的序列。在该方法中，通过扩增可用原始DNA的拷贝覆盖整个颗粒。该技术主要用于测序仪中。在该技术中，每次仅在固相或液相上扩增一条确定的链。在蛋白质扩增或蛋白质合成中，存在通过适合的生物化学系统可被首先基本转录至RNA然后转录至蛋白质的DNA链。如果RNA是足够稳定的，或者有足够数量的DNA模板，则可制备大量的蛋白质。该技术对应于发生在细胞内的涉及从DNA经RNA产生蛋白质的天然过程，并且它是生物化学的基础和中心法则。近期以来可获得简化的生物化学系统，其能够完成这一复杂的任务并且因此至少在理论上使能够在实验室中从DNA链制备蛋白质。就这一方面而言，[7]记载了从DNA微阵列直接制备蛋白质微阵列的方法，[8]记载了用cDNA锚蛋白制备蛋白质阵列的方法。可替换地，还可使用向其中引入了蛋白质编码DNA的原核或真核细胞进行蛋白质扩增。对于DNA序列的解码，可采用所谓的测序法，相对近期的测序法的综述提供于[13]。另外，DNA结合至颗粒的测序法记载于[14]。用于测序的高度复杂的仪器采用多个反应步骤和技术用于首先包裹已分离的DNA，将其扩增，然后逐个读取其构建单位。通过所选择的反
应化学和测序方法，有可能借助昂贵的生物信息学方法以整体重新计算DNA序列并且因此获得所研究物种的基因组。前文所述测序技术包括在凝胶中分离(split)DNA。这是一种不基于固相的方法并且被称作Sanger测序法。使用最新一代的测序仪人们可以利用油包水乳液PCR并且生成数百万个分别携带不同DNA片段的相同拷贝的颗粒，例如珠粒。对于读取序列而言，将颗粒排列在例如具有130-340万个不同微腔的所谓PicoTiterPlateTM中并且将其固定化。这已经表现出像这样的微阵列。就这一点而言，请参考[15]，其中记载了利用桥式扩增测序。尽管在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备分子(16，32，50)阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子(16，32，50)样品的空间排布，所述方法包括：为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域(24，35，54)分离的空间受限的有效区域(24，35，54’)，位于所述有效区域(24，35，54’)的边界上的载体(20，34，60)的具有结合接头(22，38，62)或结合性质的表面；通过所述有效区域(24，35，54’)内的扩增剂来扩增所述分子(16，32，50)，从而产生所述样品的复制物(18，32，64)或衍生物；通过所述结合接头或结合性质(22，38，62)使所述样品的复制物或衍生物(18，32，64)结合至所述载体(20，34，60)，从而使所述载体上的所述样品的拷贝或衍生物的空间排布对应于所述阵列中的所述样品的空间排布；以及从所述阵列除去包含所述样品的复制物或衍生物(18，32，64)的所述载体(20，34，60)。

【技术特征摘要】
2009.03.06 DE 102009012169.21.一种制备分子(16，32，50)阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子(16，32，50)样品的空间排布，所述方法包括：为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域(24，35，54)分离的空间受限的有效区域(24，35，54’)，位于所述有效区域(24，35，54’)的边界上的载体(20，34，60)的具有结合接头(22，38，62)或结合性质的表面；通过所述有效区域(24，35，54’)内的扩增剂来扩增所述分子(16，32，50)，从而产生所述样品的复制物(18，32，64)或衍生物；通过所述结合接头或结合性质(22，38，62)使所述样品的复制物或衍生物(18，32，64)结合至所述载体(20，34，60)，从而使所述载体上的所述样品的拷贝或衍生物的空间排布对应于所述阵列中的所述样品的空间排布；以及从所述阵列除去包含所述样品的复制物或衍生物(18，32，64)的所述载体(20，34，60)。2.根据权利要求1所述的方法，-其中，产生空间受限的有效区域包括产生空间受限的扩增剂区域(24，35)，或-其中，所述空间受限的扩增剂区域(24，35)至少部分地由所述阵列的阵列基片(10)内或所述载体(34)内的微结构或纳米结构(12，36)限定，或-其中，所述微结构或纳米结构包括特别是基于滤膜、水凝胶或气凝胶的无序基质，或其中，所述微结构或纳米结构是基于有序的三维基片。3.根据权利要求1所述的方法，-其中，为每个样品产生至少一个空间受限的扩增剂区域(24)包括将所述样品提供于所述阵列基片(10)内分离地相互关联的凹槽(12)内，将所述扩增剂引入所述凹槽(12)中，并且用所述载体(20)封闭所述凹槽(12)，或-其中，至少部分地通过两种液体(54，56)、液体和气体之间的相界，或者物理边界，特别是脂膜，分离所述空间受限的扩增剂区域(54’)，或-其中，至少部分地通过两种液体(54，56)、液体和气体之间的相界，或者物理边界，特别是脂膜，分离所述空间受限的扩增剂区域(54’)，并且其中，为每个样品产生至少一个空间受限的扩增剂区域包括将所述样品提供于相互分离的液滴(54)中，所述液滴(54)包含所述扩增剂并且固定在所述阵列的阵列基片(52)上的空间排布中，在所述液滴(54)之间排布更为稀薄的液体(56)，并且相对于所述阵列基片(52)排布所述载体(60)，使得所述载体(60)的具有所述结合接头(62)的表面位于所述液滴(54)的边界上。4.根据权利要求2所述的方法，其中，产生至少一个空间受限的扩增剂区域(35)包括提供具有至少一个凹槽(36)的载体(34)，将所述扩增剂引入所述凹槽(36)中，以及通过所述阵列基片(30)封闭所述凹槽(36)，从而使所述样品暴露于所述扩增剂区域(35)，所述凹槽(36)与每个样品关联并且具有结合接头(38)排布于其中。5.根据权利要求1所述的方法，其中，为每个样品提供空间受限的扩增剂区域包括将所述样品提供于测序仪芯片(10)或纳米孔板内。6.根据权利要求1所述的方法，-其中，与所述扩增同时进行将所述复制物或衍生物结合至所述载体的过程，或-其中，所述有效区域的空间限定在于：在所述载体上存在作为互补引物、形式为包含规则或不规则的斑点分布的引物阵列的所述结合接头，所述载体上的斑点大小和斑点密度与所述阵列上的相等或比所述阵列上的更小。7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过应用能量场实现所述有效区域的空间限定。8.根据权利要求1所述的方法，其中，以结合至颗粒(14，50)的分子的形式提供所述样品。9.根据权利要求1所述的方法，-其中，所述分子阵列为非合成的生物分子阵列，或-其中，所述分子是单链或双链的寡聚核苷酸、多聚核苷酸、DNA或类似于DNA的合成分子(PNA)，或-其中，所述阵列由用于衍生基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗兰·泽格莱，费利克斯·冯斯泰滕，京特·罗斯，约亨·霍夫曼，
申请(专利权)人：弗赖堡阿尔伯特路德维格大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE