NRAS基因突变检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种NRAS基因突变检测体系及其试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、NRAS基因质控特异探针、内标引物对和内标特异探针；检测引物探针内标混合液有四种，各种检测引物探针内标混合液包括两个针对NRAS基因不同突变位点的检测特异引物对、NRAS基因特异探针、内标引物对和内标特异探针。本发明专利技术试剂盒采用多重PCR反应体系分四次检测包括G34A、G34T、G35A、G38A、C181A、A182G、A182T和A183T在内的八个突变位点，有效避免假阴性、批内和批间差及模板质量问题引起的结果偏差，实现高效、低成本、高灵敏度和准确性，适合标准化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因突变的检测产品，属于生物

技术介绍
RAS基因在肿瘤形成和细胞增殖分化调控中起着重要作用。NRAS是RAS基因家族中的一员，与人类早幼粒细胞性白血病密切相关，长度大约为4.3kb。NRAS在许多不同的情况下传送细胞增殖和存活信号，也常常在癌细胞中发生突变组成性激活。黑色素瘤患者大约有一半的黑色素瘤患者有BRAF基因的突变，而四分之一的患者有NRAS基因突变。2012年Nature Medicine上得克萨斯大学MD安德森癌症中心科学家的研究证实了一种新的药物组合，即以Cdk4为药物靶标的抑制剂与MEK抑制剂联合使用可以治疗NRAS突变的黑色素瘤患者。另据2013年发表在Lancet Oncology上的一项Ⅱ期临床试验研究显示，对于NRAS基因变异的黑色素瘤患者，MEK162是第一个有效的靶向治疗药物，并且可能为几乎无有效治疗方法的癌症患者提供一种新的治疗选择。同年来自ESMO的PRIME研究的肿瘤基因分析显示，KRAS,NRAS和BRAF突变可作为转移性结肠癌(mCRC)接受帕尼单抗(pmab)+FOLFOX一线治疗的生物学预测指标。另一方面，Nras基因突变还可能是急性髓系白血病(AML)发生发展的原因之一，其机制可能是由于突变导致编码的Ras蛋白构型改变,使其处于功能持续活化状态，从而激活了Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt等下游信号传导通路,最终导致AML的发生。另外部分患者所发生的肝癌NRAS基因突变也成为了临床研究的新话题，相应的药物也在不断地研发中。Nras基因突变检测对于临床诊断和用药指导均具有重要参考价值。目前Nras的检测方法主要有液相芯片技术和测序等。本专利技术利用扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)衍生的系列技术，采用四组二重PCR反应检测NRAS基因八个热点突变位点。
技术实现思路
本专利技术公开了一种可通过四次反应快速准确检测NRAS基因八个热点突变位点的NRAS基因突变检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种NRAS基因突变检测体系，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液；所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、NRAS基因质控特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液包括检测引物探针内标混合液A、检测引物探针内标混合液B、检测引物探针内标混合液C和检测引物探针内标混合液D；所述检测引物探针内标混合液A包括NRAS基因G34A突变检测特异引物对、NRAS基因G34T突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液B包括NRAS基因G35A突变检测特异引物对、NRAS基因G38A突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液C包括NRAS基因C181A突变检测特异引物对、NRAS基因A182G突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液D包括NRAS基因A182T突变检测特异引物对、NRAS基因A183T突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述质控引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述质控引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述NRAS基因质控特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因G34A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G34T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G35A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G38A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因C181A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182G突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID
No.12所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A183T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因12/13密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因61密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述内标引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述内标特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述探针均带有荧光基团。上述NRAS基因质控特异探针和内标特异探针的5’端带有相互区别的报告荧光基团，所述NRAS基因质控特异探针、NRAS基因12/13密码子特异探针和NRAS基因61密码子特异探针的5’端带有相同的报告荧光基团，所述NRAS基因质控特异探针、NRAS基因12/13密码子特异探针、NRAS基因61密码子特异探针和内标特异探针的3’端均带有淬灭荧光基团。上述相互区别的报告荧光基团有两种，第一种是FAM、Cy5或ROX，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3；所述淬灭荧光基团是BHQ1。上述与荧光基团相关的另一技术方案是：上述NRAS基因质控特异探针、NRAS基因61密码子特异探针和内标特异探针的5’端带有相互区别的报告荧光基团，所述NRAS基因质控特异探针和NRAS基因12/13密码子特异探针的5’端带有相同的报告荧光基团，所述NRAS基因质控特异探针、NRAS基因12/13密码子特异探针、NRAS基因61密码子特异探针和内标特异探针的3’端均带有淬灭荧光基团。上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3，第三种是Cy5或ROX；所述淬灭荧光基团是BHQ1。本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的检测体系的NRAS基因突变检测试剂盒。上述NRAS基因突变检测试剂盒包括PCR反应液，阳性对照液A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2，以及阴性对照液；阳性对照液A1是含NRAS基因G34A突变阳性质粒的野生型基因组DNA水溶液；阳性对照液A2是含NRAS基因G34T突变阳性质粒的野生型基因组DNA水溶液；阳性对照液B1是含NRAS基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NRAS基因突变检测体系，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，其特征在于：所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、NRAS基因质控特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液包括检测引物探针内标混合液A、检测引物探针内标混合液B、检测引物探针内标混合液C和检测引物探针内标混合液D；所述检测引物探针内标混合液A包括NRAS基因G34A突变检测特异引物对、NRAS基因G34T突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液B包括NRAS基因G35A突变检测特异引物对、NRAS基因G38A突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液C包括NRAS基因C181A突变检测特异引物对、NRAS基因A182G突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液D包括NRAS基因A182T突变检测特异引物对、NRAS基因A183T突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述质控引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述质控引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述NRAS基因质控特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因G34A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G34T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G35A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G38A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因C181A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182G突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A183T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因12/13密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因61密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述内标引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述内标特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述探针均带有荧光基团。...

【技术特征摘要】
1.一种NRAS基因突变检测体系，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，其特征在于：所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、NRAS基因质控特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液包括检测引物探针内标混合液A、检测引物探针内标混合液B、检测引物探针内标混合液C和检测引物探针内标混合液D；所述检测引物探针内标混合液A包括NRAS基因G34A突变检测特异引物对、NRAS基因G34T突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液B包括NRAS基因G35A突变检测特异引物对、NRAS基因G38A突变检测特异引物对、NRAS基因12/13密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液C包括NRAS基因C181A突变检测特异引物对、NRAS基因A182G突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述检测引物探针内标混合液D包括NRAS基因A182T突变检测特异引物对、NRAS基因A183T突变检测特异引物对、NRAS基因61密码子特异探针、内标引物对和内标特异探针；所述质控引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述质控引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述NRAS基因质控特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因G34A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G34T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G35A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因G38A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述NRAS基因C181A突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182G突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A182T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因A183T突变检测特异引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述NRAS基因12/13密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述NRAS基因61密码子特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述内标引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述内标特异探针的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述探针均带有荧光基团。2.根据权利要求1所述的NRAS基因突变检测体系，其特征在于：所述NRAS基因质控特异探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，金芬芬，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31