本发明专利技术公开了一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由BOE456和BOE622组成。利用该分子标记组中的BOE456和BOE622的引物序列进行PCR验证，可对‘秋绿芥蓝’杂交种子和其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子检测领域，具体涉及一种用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。
技术介绍
芥蓝是起源于华南地区的一种特色叶菜，为甘蓝的一个变种。‘秋绿芥蓝’是以612♀为母本（自交不亲和系），Sb06F为父本育成的一代杂交种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的品种。但是由于有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现，使得品种间，尤其是杂交品种之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之‘秋绿芥蓝’是利用自交不亲和系配制而成的杂交一代，母本在制种过程中有少量的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子纯度下降，给生产造成巨大损失。为了避免这种损失，需要对种子的纯度和真伪进行鉴定。目前品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法虽然从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但是在大规模检测中存在耗时较多，错误率较高的缺点，因而不利于大规模推广。因此为了保证优良品种发产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用SSR分子标记技术提供一种用于快速、准确鉴定“秋绿芥蓝”杂交种子纯度的引物及方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由BOE456和BOE622组成。优选的，SSR 分子标记BOE456的引物对序列如下所示 ：BOE456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)BOE456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)。优选的，SSR 分子标记BOE622的引物对序列如下所示 ：BOE622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’ (SEQ ID NO:5)BOE622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’ (SEQ ID NO:6)。一种用于 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：1） 提取芥蓝幼苗基因组DNA；以芥蓝基因组DNA为模板，使用BOE456和/或BOE622的SSR引物进行PCR扩增；2） 对扩增的产物进行凝胶电泳；对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株为杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。本专利技术的有益效果是：将‘秋绿芥蓝’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。附图说明图1为引物BOE456 ‘秋绿芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P1：母本a；P2：父本b：F1为杂交一代种子）；图2为引物BOE622‘秋绿芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中1孔为M，2孔父本，3孔母本，其它15株分别是杂交种的1-15个单株；图3 为‘秋绿芥蓝’商品种种植后取叶片DNA进行电泳跑胶的图片，其中1孔为Marker，2孔父本，3孔母本，其它20株分别是杂交种的1-20个单株，其中19株为假杂种。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度检测方法的建立1、筛选纯度鉴定的SSR引物。从所公布的甘蓝SSR引物及EST-SSR引物在双亲间进行筛选，选出共显性差异标记条带的两对引物序列如下所示：BOE456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)BOE456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)BOE622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT-3’(SEQ ID NO:5)BOE622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT-3’(SEQ ID NO:6)二种标记带型清晰、重复性好。引物能产生的母本特异性标记和的父本特异性标记。2、利用上述特异性引物对 ‘秋绿芥蓝’ 杂交种子进行纯度鉴定。（1）芥蓝DNA的提取实验材料为‘秋绿芥蓝’商品种及其母本、父本幼嫩真叶DNA。步骤如下：①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μL 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min（每隔5min摇动一次）。②静置至室温后在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清（约800μL）转移到新的2ml 离心管。③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml 离心管中。④加2/3体积340μL预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次），置于－20℃下培养30min。⑤在4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μL预冷的 70%乙醇洗涤DNA沉淀（两次），微干。⑥加入100μL无菌水溶解。（2）SSR-PCR 扩增：PCR体系（20μL）DNA模板：5ng引物-F：0.25 mmol•L-1引物-R：0.25 mmol•L-1dNTP：0.2mmol•L-1Mg2+：0.15mmol•L-110×PCR buffe：2.0μLTaq酶：0.2UddH20补足至20μLPCR扩增程序94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。（3）凝胶电泳扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgNO3银染15min；银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2CO3显色，显色后在灯箱上拍照分析。（4）扩增结果两种引物在‘秋绿芥蓝’父母本及杂交种子分别能扩增出两条特异带；其中BOE456引物母本p1扩增出的a条带，母本p2号扩增出b的条带(见图1）；BOE622引物扩增出来的条带如图2所示。回收BOE456引物扩增出来的特异条带，送上海生物工程有限公司测序。条带的序列如SEQ ID NO:1-2所示，杂交种子中与父本、母本扩增产物的序列相符。实施例2 检测准确度验证采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的100株‘秋绿芥蓝’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测（部分电泳图见图3），种子纯度为99%，与田间调查结果一致，准确率为100%。以上实施例表明，本专利技术的方法可将‘秋绿芥蓝’杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。并且选取任何一个引物均能准确鉴别。<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所<120> 用于'秋绿芥蓝'杂交种子纯度的鉴定的引物及方法<130> Cabbage mustard<160> 6 <170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 210<212> DNA<213> 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由BOE456和BOE622组成，SSR分子标记BOE456包括母本612♀和父本Sb06F，其母本612♀的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，SSR分子标记BOE622可由引物对：BOE622‑F:5’‑ GTCTCGCTCGCCTAACACTT ‑3’和BOE622‑R: 5’‑ AGAGCGGGAGGAGGGATGGT ‑3’扩增得到。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由BOE456和BOE622组成，SSR分子标记BOE456包括母本612♀和父本Sb06F，其母本612♀的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，SSR分子标记BOE622可由引物对：BOE622-F:5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’和BOE622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’扩增得到。2.一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的引物组，由用于扩增SSR 分子标记BOE456的引物对和用于扩增SSR 分子标记BOE622的引物对共同组成。3.根据权利要求2 所述的引物组，其特征在于：SSR 分子标记BOE456的引物对序列如下所示 ：BOE456-F: 5’- GATGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈汉才，李桂花，王亭亭，张艳，黎庭耀，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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