检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法和引物，LAMP引物组合物由4条引物组成。本发明专利技术还同时公开了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，除了包含上述LAMP引物组合物之外，还包括10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl

【技术实现步骤摘要】
检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法
本专利技术属于生物
，涉及环介导等温扩增(LAMP)技术检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警

技术介绍
山核桃干腐病从2002年开始在临安、淳安、桐庐等山核桃产区普遍发生，受害面积逐步扩大，目前发生面积达27万亩，发生严重的整株枯死，轻的影响生长造成落果，据测算发生区平均产量减少24％左右，成为山核桃产业发展的瓶颈。有不同的研究报道或推测不同的因素和山核桃干腐病的发生有关。本实验室研究发现茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，即，山核桃干腐病菌(Bdothidea)是引起山核桃干腐病的主要病原，且山核桃的发生严重程度主要与其生物学和流行特性有关。连续5年的观察发现，该病原菌以菌丝体在病组织内越冬，第二年春季气温上升病菌开始活跃，在树皮表面形成子实体并释放孢子，进行再侵染。孢子借风雨传播，侵入树皮细胞或树体伤口后表现明显的“潜伏侵染”特性，从3月下旬开始到11月都有不同程度的病害发生。4月中旬至6月中旬气温在25℃—30℃是孢子释放侵染的高峰期的高峰，7～8月气温30℃以上的高温天气不利于病菌的发展，秋季气温下降至30℃以下又会产生病菌的发展(未报道资料)。因为该病菌长期处于“潜伏侵染”状态，一旦等其潜伏的共生状态转变到腐生致病状态，形成肉眼可见的病斑，再采取防治措施，已经为时已晚。防治效果会很不理想。所以，要高效地防治山核桃干腐病，在其潜伏的共生状态期的早期快速检测就非常重要。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测山核桃干腐病菌，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本荣研株式会社专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。但是，引物的设计不容易获得。此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩增，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害；长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，以HNB的颜色变化做为结果判定标准即可，达到快速检测的目的。靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有β微管蛋白基因，后逐步发展起来成为分子标记，其优点在于：具有高拷贝数；同时包含保持与变异序列；能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较。虽然真菌的β-tublin总的说来是相对保守的，但其间有足够的变异位点可以用于鉴别性比较，而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵敏。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组合物；本专利技术还提供该引物组合的应用；本专利技术还提供一种检测山核桃干腐病病菌的LAMP试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物：LAMP引物组合物由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。本专利技术还同时提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述LAMP引物组合物。作为本专利技术的试剂盒的改进：LAMP引物组合物为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。作为本专利技术的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含如下：10×ThermoPolBuffer、dNTPs(1mM)、MgCl2(4mM)、甜菜碱(0.6M)、羟基萘酚蓝(150μM，HNB)、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。备注：上述成分组成了环介导等温扩增反应预混液。本专利技术还同时提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法，25μL反应体系由以下成分组成：8U/μLBstDNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μMFIP2.0μL、20μMBIP2.0μL、10μMF30.5μL、10μMB30.5μL、25mMMgCl24.0μL、10mMdNTPs2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH2O(双蒸水)补足至25μL。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的改进：利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果观察到天蓝色判断为阳性，判定显示检测到山核桃干腐病病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，判定显示样品无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌含量未达检测的最低检测浓度；方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到山核桃干腐病病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无山核桃干腐病病菌，或所含山核桃干腐病病菌未达最低检测浓度。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的进一步改进：LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的进一步改进：所述方法一、方法二中的最低检测浓度均为0.01ng/μL。本专利技术提供了LAMP引物组合物在检测山核桃干腐病病菌LAMP试剂盒中的应用，以及提供了一种用于检测山核桃干腐病病菌的LAMP试剂盒，包含本专利技术所述的引物组合物。本专利技术中，检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系。本专利技术的方案具体如下：1、引物的设计：所述的用于检测山核桃干腐病菌的特异性引物组是通过扩增获得山核桃干腐病菌大量菌株的β-Tublin基因核酸序列，并和其它茶藨子葡萄座腔菌的β-Tublin基因核酸序列进行比对，针对保守区片段序列进行设计。其中由一对上下游外引物和一对上下游内引物，共四条引物组成，内引物和外引物的终浓度以8:1的比例进行配制。为检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC‑GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT‑AACGCGAATCGACACCACAG—3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外引物F3：5’—CGCGTTCAGAAGATTGCCATA—3’；下游外引物B3：5’—TTGTTGCCAAAACACCCGC—3’；上游内引物FIP：5’—GCGTGGGAGAACATCAATGAC-GCTCGAGCTGAAGGTCCG—3’；下游内引物FIB：5’—CTTACACGCCAGAGCCGT-AACGCGAATCGACACCACAG—3’。2.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合物为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含如下：10×ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl2、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。5.用于检测山核桃干腐病病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：25μL反应体系由以下成分组成：8U/μLBstDNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μMFIP2....

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，童琪，张佳星，戴德江，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33