灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物；本发明专利技术还同时公开了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒除了包含上述LAMP引物组合物，还包含10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl

【技术实现步骤摘要】
灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法
本专利技术属于生物
，涉及环介导等温扩增技术检测含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定、防治及病原菌抗药性风险预警的

技术介绍
灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)属于半知菌类丝孢纲丝孢目葡萄孢属，是一条件致病菌，腐生性强，属坏死型植物病原真菌，具有潜伏侵染的特点，潜伏期较长。灰葡萄孢的寄主专化性不强，寄主范围广，可侵染230多种植物，不同寄主植物间的灰葡萄孢可交互侵染，因而很难像专性寄生菌那样发现有效的抗病材料，故而很难培育出抗病品种。灰霉病菌因具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，使其极易对杀菌剂产生抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoIs)是一类来源于具有杀菌活性的天然抗生素strobilurinA的新型杀菌剂，包括嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯等药剂，具有广谱高效的抗菌活性。由于其具有独特的作用靶标，与其它现有的杀菌剂不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用于真菌线粒体呼吸链上的复合体III，通过与细胞色素b基因编码的cytb的Qo位点结合来抑制呼吸链上的电子传递，进而影响呼吸作用阻碍病原真菌的合成，干扰细胞正常分裂和生长，进而造成菌体死亡。从1996年欧洲开始使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂防治小麦白粉病到现在，灰霉病菌对嘧菌酯等QoI药剂产生了明显的抗药性。据报道，CYTB上的点突变G143A，F129L和G137R可以引起灰霉病菌对QoI药剂不同水平的抗药性，但是，灰霉病菌田间抗性的产生主要是因为点突变G143A，药剂压力可以提高G143A突变基因的频率，而且该点突变引起的抗性水平稳定。研究表明灰霉病菌中存在2种类型的cytb基因：Ⅰ型cytb基因在第143位密码子后紧跟内含子；Ⅱ型cytb基因在第143位密码子后没有紧跟内含子。灰霉病菌对QoI药剂产生抗性的机制主要是菌株的cytb基因的第143位密码子由甘氨酸(GGC)突变为了丙氨酸(GCC)，即抗药性机制为cytb基因的G143A点突变。QoI药剂是目前市场占有率最高的一类杀菌剂，但是容易抗药性是其面临的主要问题。一旦产生抗药性，药剂的防治效果就会显著降低甚至完全失效。农民就会不断提高药剂的使用剂量，不但防治效果不佳，用药量过高后还可能带来农产品安全和环境安全问题。因此，在防治灰霉病时，在施药前如果能快速确定该地的灰霉病菌是否对QoI药剂容易产生抗药性，对于指导科学用药具有十分重要的意义。而普通的生物测定技术或者PCR等分子生物学技术都不能达到这一要求，生物测定技术需要的时间很长(至少1周以上)、工作量达；PCR等分子生物学技术不但需要昂贵的仪器设备还需要熟练的高级技术操作人员。且目前的生物测定技术或者PCR等分子生物学技术都是用于时候测定病菌对药剂的抗性状况。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是于2000年由Notomi等首次专利技术、报道的一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的个区域设计条特异性引物，在链置换DNA酶(BstDNApolymerase)的作下，60～65℃恒温扩增，60min左右即可观察结果，具有操作简单、快速、特异性强、产检测便捷等特点。在反应液中添加适当的染料和金属离子，通过指示反应液颜色变化来判断反应结果，加入HNB(羟基萘酚蓝)，在日光灯下通过肉眼即可观察到颜色变化，阳性反应结果会由蓝紫色变成天蓝色。从扩增原理可知，扩增过程中会产生大量大小不一的片段(即茎环DNA、若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构)，当用的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测时，会出现一系列呈梯状的电泳条带。因此，可以利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，来判断是否进行扩增。待测样品为阳性时，会出现呈梯状的电泳条带，反之，不出现呈梯状的电泳条带。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法，即，一种用于检测含有BCbi143/144内含子灰霉病菌的环介导等温扩增方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，该LAMP引物组合物由SEQIDNO.1所示的正向外引物F3，SEQIDNO.2所示的反向外引物TB3，SEQIDNO.3所示的正向内引物FIP，SEQIDNO.4所示的反向内引物BIP组成；本专利技术还同时提供了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述LAMP引物组合物。作为本专利技术的试剂盒的改进：LAMP引物组合物的浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。作为本专利技术的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含：10×ThermoPolBuffer、dNTPs(1mM)、MgCl2(5mM)、甜菜碱(0.8M)、羟基萘酚蓝(150μM，HNB)、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。备注：上述成分组成了环介导等温扩增反应预混液。本专利技术还同时提供了一种用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增方法：25μL反应体系由以下成分组成：8U/μLBstDNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μMFIP2.0μL、20μMBIP2.0μL、10μMF30.5μL、10μMB30.5μL、25mMMgCl25.0μL、10mMdNTPs2.5μL、5M甜菜碱4.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，ddH2O(双蒸水)补足至25μL。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的改进：利用25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，扩增结果的分析和判定方法为选择以下任一：方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果为天蓝色判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即显示样品无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌含量未达检测限；方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含的有BCbi143/144内含子的灰霉病菌未达检测限。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的进一步改进，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。作为本专利技术的环介导等温扩增方法的进一步改进：所述方法一、方法二中的检测限DNA浓度为1pg/μL。本专利技术的LAMP引物组合物能用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌。在本专利技术中，依据灰葡萄孢菌cytb基因第143位氨基酸后紧跟本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：F3：CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT；TB3：CGTACAGTAACCATGGGATA；FIP：TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG；BIP：CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT。

【技术特征摘要】
1.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：F3：CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT；TB3：CGTACAGTAACCATGGGATA；FIP：TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG；BIP：CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT。2.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP引物组合物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合物的浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含：10×ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl2、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。5.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：25μL反应体系由以下成分组成：8U/μLBstDNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μMFIP2.0μL、20μMBIP2.0μL、10μMF30.5μL、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，胡小然，时浩杰，戴德江，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33