番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。其外侧引物对为F3/B3、内侧引物对为FIP/BIP；试剂盒包括LAMP反应混合液、1对外侧引物F3/B3、1对外侧引物FIP/BIP、8 U Bst聚合酶和核酸染料1000×SYBR Green I。通过待测样品DNA 提取、环介导等温扩增、显色检测等三步即可检测到是否感染番茄灰霉病菌。本发明专利技术根据番茄灰霉病菌ITS序列设计引物，采用LAMP 技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便等优点，解决了现有技术中存在的周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，在番茄灰霉病菌检测方面潜力巨大。

Tomato gray mould fungus LAMP detection primer, detection reagent kit and application thereof

The invention discloses a tomato gray mould fungus LAMP detection primer, a detection reagent kit and application thereof. The outer primer F3/B3, primer pair FIP/BIP; kit includes a mixed solution, the reaction of LAMP 1 on F3/B3 1 on the lateral outer primer, primer FIP/BIP, 8 U Bst polymerase and a nucleic acid dye 1000 * SYBR Green I. Through the sample of DNA extraction, loop mediated isothermal amplification and color detection of three steps to detect whether or not infected with Botrytis cinerea. According to the invention of Botrytis cinerea ITS primers were detected by LAMP technology, strong specificity and high sensitivity, has the advantages of rapid, high accuracy, good sensitivity, simple and convenient for application, solves the defects existing in the prior art of long cycle, low sensitivity, high cost, application difficulties and so on. The huge potential in the detection of Botrytis cinerea.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及一种番茄灰霉病菌LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于番茄灰霉病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
技术介绍
番茄（LycopersiconseculentumMill）是一种在世界范围广泛种植的蔬菜作物，也是我国主要的蔬菜消费品种之一。近年来，番茄栽培面积逐年增加，与此同时，番茄病虫害防治工作从理论到实践都取得了很大进步。番茄是病害种类最多的蔬菜作物之一，病害严重制约了番茄产业的发展。其中，由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）侵染引起的番茄灰霉病是番茄设施栽培中高危害、高损失且影响蔬菜产量、品质、安全的最主要病害之一。该菌可通过侵染番茄植株的叶片、茎杆、花和果实导致番茄灰霉病的发生，病原菌在土壤或病残体上能以菌丝或菌核形式休眠越过冬天或夏天，温湿度适宜时萌发形成大量的分生孢子后凭风雨飞散或借农事操作传播引起番茄植株感病，发病处新生的灰霉分生孢子能够进行重复再侵染，从而导致病情极易扩展和加重。在中国，番茄灰霉病一般年份造成20%左右的减产，严重时超过50%，甚至绝收；该病已在全国各地普通发生，且呈上升趋势，成为当前番茄生产上的重要病害。因此，建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄灰霉病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄灰霉病的及时控制具有重要意义。植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多；但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性；PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，对于需要快速通关的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，需要开发新型的、快速、简便、可靠且低成本的检测手段。环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。和常规扩增方法相比，该技术主要优点体现在如下几个方面：1)该方法仅需水浴或金属浴等恒温装置，以提供实现核酸扩增的条件，不需要热循环仪等贵重设备；2)特异性高，采用4条特异引物识别目的基因上的6个区域；3)扩增速度快，效率高，1小时内扩增效率达到109~1010个数量级，可在30-60分钟内获得结果；4)结果判定简单，扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，无需电泳，结果可经肉眼直接判断，结合使用荧光染料或试纸条，检测结果更为灵敏可靠，结合专门开发的浊度仪，可实时观测扩增进程，可使检测时间缩短至15分钟。目前已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测番茄灰霉病菌的试剂盒及方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对番茄灰霉病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了番茄灰霉病菌新的分子检测方法，对番茄灰霉病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.番茄灰霉病菌LAMP检测引物：通过测定番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）和其它灰霉病菌（Botrytisspp）的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对灰霉菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件PrimersoftwareExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;EikenChemicalCo.,Japan)设计一套番茄灰霉病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3:5’-AGCTTG-TCGACCAAGTTCTT-3’，B3:5’-ACGGTATCGGAAACCTTTGG-3’，FIP:5’-CCACCACCGAGAGAGTGGGTAA-TCGTGAAGCTGAAGGCTGT-3’，BIP:5’-TCTCCAAGATCCGCGAGGAGT-CGATGGGACGACGGAGAA-3’。2.一种利用权利要求1所述引物制备的番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒：包括1对外侧引物F3/B3、1对外侧FIP/BIP、LAMP反应混合液，8UBst聚合酶和核酸染料1000×SYBRGreenI；其中LAMP反应混合液由40mMTris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mMKCl，16mMMgSO4，1.6mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0mMdNTPs和0.2%TrionX-100组成。3.一种利用上述番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒检测番茄灰霉病菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
番茄灰霉病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：F3: 5’‑ AGCTTGTCGACCAAGTTCTT‑3’，B3: 5’‑ ACGGTATCGGAAACCTTTGG‑3’，FIP: 5’‑ CCACCACCGAGAGAGTGGGTAATCGTGAAGCTGAAGGCTGT‑3’，BIP: 5’‑ TCTCCAAGATCCGCGAGGAGTCGATGGGACGACGGAGAA‑ 3’。

【技术特征摘要】
1.番茄灰霉病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：F3:5’-AGCTTGTCGACCAAGTTCTT-3’，B3:5’-ACGGTATCGGAAACCTTTGG-3’，FIP:5’-CCACCACCGAGAGAGTGGGTAATCGTGAAGCTGAAGGCTGT-3’，BIP:5’-TCTCCAAGATCCGCGAGGAGTCGATGGGACGACGGAGAA-3’。2.一种利用权利要求1所述引物制备的番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，其组分为：一对外侧引物F3/B3、一对内侧引物FIP/BIP、LAMP反应混合液、8UBst聚合酶以及核酸染料1000×SYBRGreenI。3.如权利要求2所述的一种番茄灰霉病菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应混合液由40mMTris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mMKCl，16mMMgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mMdNTPs和0.2%TrionX-100组成。4.一种利用权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰成忠，姚锦爱，阮宏椿，吴玮，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35