检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒。其中检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针，包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针，以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针。本发明专利技术涉及的ApoE和SLCO1B1基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因多态性检测
，特别涉及检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。同时在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够起到抑制血管内皮的炎症反应、稳定粥样斑块、改善血管内皮功能、延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。人类载脂蛋白E(ApoE)基因位于19号染色体上，有4个外显子和3个内含子，ApoE基因两个最常见的突变为T388C和C526T，能形成3个单倍体，分别为E2(388T-526T)、E3(388T-526C)、E4(388C-526C)，可形成6个基因型(E3/3、E2/3、E3/4、E/4/4、E2/2、E2/4)。研究表明，ApoE的基因位点具有遗传多态性，多态性与个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。E2等位基因携带者，其血液中ApoE浓度高，胆固醇含量低，对动脉粥样硬化有防护作用；而E4等位基因携带者，则血液中ApoE浓度低，胆固醇及三酰甘油含量高，是动脉粥样硬化的潜在危险因素。另外，ApoE基因多态性是他汀类药物调脂疗效出现个体差异的重要原因之一，研究表明，E2等位基因携带者对于他汀类药物的疗效优于E3，E4携带者。有机阴离子转运多肽1B1(OATP1Bl)参与他汀类药物的转运，其编码基因为SLCO1B1，人类SLCO1B1基因位于12号染色体上，全长108.59kb，有14个编码外显子和一个非编码外显子。SLCO1B1基因的两个最常见的突变为A388G和T521C，能形成可以形成4种单倍体，分别是SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。SLCO1B1多态性可造成他汀类药物药动学的改变，突变型SLCO1B1基因可使OATP1B1与底物的亲和力降低，转运活性下降，阻碍他汀类药物的代谢，造成进入外周循环的药物增多，增加肌毒性副作用的发生风险。目前，针对ApoE和SLCO1B1基因多态性检测的方法有多种，主要包括DNA测序法和高分辨率溶解曲线法。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，耗时长。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。因此需要建立一种快速操作方便，快速，特异性好、灵敏的基因检测方法。
技术实现思路
为了克服现有技术检测能力的不足，本专利技术在Taqman探针法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ApoE基因T388C、C526T和SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针，以及试剂盒。本专利技术针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从样本提取的基因组DNA进行检测，一次性就可以实现对载体蛋白E(ApoE)基因T388C和C526T、有机阴离子转运多肽1B1编码基因(SLCO1B1)A388G和T521C的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。本专利技术的具体技术方案说明如下：本专利技术提供了一组检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针，包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针，以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针，具体核苷酸序列如下：(1)ApoE基因T388C位点：T388C位点突变型ARMS上游引物：5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’(SEQIDNO.1)；T388C位点野生型ARMS上游引物：5’-CGGACATGGAGGACGAGT-3’(SEQIDNO.2)；T388C位点公用的下游引物：5’-CTGCAGGTCATCGGCATC-3’(SEQIDNO.3)；T388C位点公用的探针：5’-CGCCTGGTGCAGTAC-3’(SEQIDNO.4)；(2)ApoE基因C526T位点：C526T位点突变型ARMS上游引物：5’-GCCTGATACACTGCCTGGCA-3’(SEQIDNO.5)；C526T位点野生型ARMS上游引物：5’-GCCTGATACACTGCCTGGCG-3’(SEQIDNO.6)；C526T位点公用的下游引物：5’-GCCTCGCCTCCCACCT-3’(SEQIDNO.7)；C526T位点公用的探针：5’-CTTCTGCAGGTCATCG-3’(SEQIDNO.8)；(3)SLCO1B1基因A388G位点：A388G位点突变型ARMS上游引物：5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCG-3’(SEQIDNO.9)；A388G位点野生型ARMS上游引物：5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCA-3’(SEQIDNO.10)；A388G位点公用的下游引物：5’-ACTATCTCAGGTGATGCTCTATTGA-3’(SEQIDNO.11)；A388G位点公用的探针：5’-CAACATCGACCTTATCC-3’(SEQIDNO.12)；(4)SLCO1B1基因T521C位点：T521C位点突变型ARMS上游引物：5’-TCTGGGTCATACATGTGGATATATCCG-3’(SEQIDNO.13)；T521C位点野生型ARMS上游引：5’-CTGGGTCATACAAGTGGATCTATGT-3’(SEQIDNO.14)；T521C位点公用的下游引物：5’-GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC-3’(SEQIDNO.15)；T521C位点公用的探针：5’-CATGGGTAATATGCTTCG-3’(SEQIDNO.16)；所述探针均为TaqmanMGB探针，探针为5’端标记荧光报告基团和3’端标记荧光淬灭基团的寡核苷酸。本专利技术还提供一种检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，包括上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针。优选地，上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，还包括内部质控引物对及Taqman探针：上游引物：5’-CTGCTCGGTCTTGCTATCAAAG-3’(SEQIDNO.17)；下游引物：5’-CACTTCGCCCTGTTCTTCAAC-3’(SEQIDNO.18)；探针：5’-CAACGCTCCGCTCCACAAACTCATCATA-3’(SEQIDNO.19)；探针寡核苷酸的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，且均不同于检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的探针两端标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团。优选地，上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，还包括dNTPs、PCR缓冲液、矿物油和超纯水。优选地，上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，还包括FastmasterPremix。优选地，上述检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，还包括阳性对照品，所述阳性对照品包括分别含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针，包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针，以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针，具体核苷酸序列如下：(1)ApoE基因T388C位点：T388C位点突变型ARMS上游引物：5’‑CGGACATGGAGGACGAGC‑3’；T388C位点野生型ARMS上游引物：5’‑CGGACATGGAGGACGAGT‑3’；T388C位点公用的下游引物：5’‑CTGCAGGTCATCGGCATC‑3’；T388C位点公用的探针：5’‑CGCCTGGTGCAGTAC‑3’；(2)ApoE基因C526T位点：C526T位点突变型ARMS上游引物：5’‑GCCTGATACACTGCCTGGCA‑3’；C526T位点野生型ARMS上游引物：5’‑GCCTGATACACTGCCTGGCG‑3’；C526T位点公用的下游引物：5’‑GCCTCGCCTCCCACCT‑3’；C526T位点公用的探针：5’‑CTTCTGCAGGTCATCG‑3’；(3)SLCO1B1基因A388G位点：A388G位点突变型ARMS上游引物：5’‑AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCG‑3’；A388G位点野生型ARMS上游引物：5’‑AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCA‑3’；A388G位点公用的下游引物：5’‑ACTATCTCAGGTGATGCTCTATTGA‑3’；A388G位点公用的探针：5’‑CAACATCGACCTTATCC‑3’；(4)SLCO1B1基因T521C位点：T521C位点突变型ARMS上游引物：5’‑TCTGGGTCATACATGTGGATATATCCG‑3’；T521C位点野生型ARMS上游引：5’‑CTGGGTCATACAAGTGGATCTATGT‑3’；T521C位点公用的下游引物：5’‑GCGAAATCATCAATGTAAGAAAGC‑3’；T521C位点公用的探针：5’‑CATGGGTAATATGCTTCG‑3’；所述探针均为TaqmanMGB探针，探针为5’端标记荧光报告基团和3’端标记荧光淬灭基团的寡核苷酸。...

【技术特征摘要】
1.检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物和探针，包括检测ApoE基因T388C、C526T多态性位点的引物和探针，以及检测SLCO1B1基因A388G、T521C多态性位点的引物和探针，具体核苷酸序列如下：(1)ApoE基因T388C位点：T388C位点突变型ARMS上游引物：5’-CGGACATGGAGGACGAGC-3’；T388C位点野生型ARMS上游引物：5’-CGGACATGGAGGACGAGT-3’；T388C位点公用的下游引物：5’-CTGCAGGTCATCGGCATC-3’；T388C位点公用的探针：5’-CGCCTGGTGCAGTAC-3’；(2)ApoE基因C526T位点：C526T位点突变型ARMS上游引物：5’-GCCTGATACACTGCCTGGCA-3’；C526T位点野生型ARMS上游引物：5’-GCCTGATACACTGCCTGGCG-3’；C526T位点公用的下游引物：5’-GCCTCGCCTCCCACCT-3’；C526T位点公用的探针：5’-CTTCTGCAGGTCATCG-3’；(3)SLCO1B1基因A388G位点：A388G位点突变型ARMS上游引物：5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCG-3’；A388G位点野生型ARMS上游引物：5’-AGGTATTCTAAAGAAACTAATGTCA-3’；A388G位点公用的下游引物：5’-ACTATCTCAGGTGATGCTCTATTGA-3’；A388G位点公用的探针：5’-CAACATCGACCTTATCC-3’；(4)SLCO1B1基因T521C位点：T521C位点突变型ARMS上游引物：5’-TCTGGGTCATACATGTGGATATATCCG-3’；T521C位点野生型ARMS上游引：5’-CTGGGTCATACAAGTGGATCTATGT-3’；T521C位点公用的下游引物：5’-GCGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志伟，段卫涛，史学辉，裴冰雪，胡利红，赵平锋，卢彦羽，肖红涛，张全，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42