一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测引物与试剂盒，具体公开了检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。所述引物如下：上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；所述探针为：5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。本发明专利技术选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明专利技术提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明专利技术提供的引物和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的犬钩体病荧光定量PCR试剂盒检测灵敏度为10°copies/μL，钩体浓度检测灵敏度为1×101钩体/mL，可满足检测需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。
技术介绍
钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种在全世界范围传播的人畜共患疾病，简称钩体病，该病尤其广泛存在于发展中国家和热带地区。犬对该病易感，感染后临床表现多样，不易进行诊断。钩体病的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感染其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健康的同时，还会威胁到其主人的安全。因此，需要在早期对该病作出诊断，尽早控制该病。目前，诊断犬钩体病的方法有直接镜检、分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法，与这些方法相比，PCR方法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。公开号为CN103205502A的中国专利申请公开了一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR的引物、探针及试剂盒，所述引物针对致病性狗钩端螺旋体的LigA基因序列设计。然而，在众多钩体的血清型中，其中黄疸出血56601型没有LigA基因，而黄疸出血56601型会引起钩端螺旋体病。因此上述技术方案无法对致病性狗钩端螺旋体进行全面检测。公开号为CN101935696A的中国专利申请公开了一种检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒，其采用16srRNA基因序列为设计引物。然而，致病性和非致病性钩体均含有16srRNA基因，上述技术方案通过检测16srRNA基因来检测犬猫钩端螺旋体，不能准确鉴别检测致病性和非致病性钩体。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物及试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断。本专利技术原理在于选择了犬钩端螺旋体LigB基因作为检测对象，并针对犬钩端螺旋体LigB基因特殊设计了引物，使引物具有优异的特异性和敏感性。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物，所述引物如下：上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；所述探针为：5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。本专利技术还提供了所述引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒方面的应用。由于所述引物的扩增片段能够证明犬钩端螺旋体LigB基因的存在，从而证明致病性犬钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒。在所述引物的存在下，加入配合使用的所述探针，能都在荧光PCR仪上进行荧光定量PCR的检测。基于上述原因，本专利技术还提供了含有所述引物与探针的试剂或试剂盒。具体为一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物和探针、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O。进一步地，所述阳性对照的构建方法为：1)以黄疸出血56601的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行连接；2)向Trans1-T1克隆感受态中加入步骤1)获得的连接产物，筛选阳性克隆，提取质粒。黄疸出血56601购自中国药品生物制品检定所钩端螺旋体实验室，保藏编号为56601。为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的检测，本专利技术优化了所述试剂盒的工作程序(尤其是退火温度)，使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。优化得到的工作程序为：94℃3min；94℃20s，58℃50s，读板，35个循环。应用本试剂盒进行荧光定量PCR以后，把得到的CT值带入标准曲线方程，就可以得出钩体的浓度。对钩体的检测定性就够了，但能定量更好，本试剂盒不但能定性，还能定量。为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的荧光定量检测，本专利技术还优化了所述试剂盒的工作体系(尤其是引物浓度和探针浓度)，最大程度地提高灵敏度，降低检出限。优化得到的PCR工作体系为20μL：PremixExTaq10μL，上下游引物各0.8μL，Probe0.6μL，模板1μL，ddH2O补足。本专利技术的有益效果在于：本专利技术选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本专利技术提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物、探针及试剂盒。本专利技术提供的引物、探针和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的犬钩体病荧光定量PCR试剂盒检测灵敏度为100copies/μL，钩体浓度检测灵敏度为1×101钩体/mL，可满足检测需要。附图说明图1是本专利技术实施例2中退火温度的电泳检测结果图；其中，M：2000bpMarker，泳道1～5：退火温度依次为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。图2是本专利技术实施例2中摸索引物浓度的结果图：其中，上下游引物反应终浓度梯度为0.1～0.8μM，间隔为0.1μM。图3是本专利技术实施例2中摸索探针浓度的结果图：探针反应终浓度梯度为0.1～0.5μM，间隔为0.1μM。图4是本专利技术实施例3中DNA标准品扩增曲线图：其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板。从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6ng/μL,相应的检测到的扩增起始循环数依次增大。图5是本专利技术实施例3中DNA标准品标准曲线图，X轴从左到右依次为DNA模板浓度1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6ng/μL，Y轴为CT值。图6是本专利技术实施例4中荧光定量PCR重复性试验结果，是3个不同浓度钩体DNA标准品的3个重复。图7是本专利技术实施例5中特异性试验曲线图，其中从左到右为标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照。图8是本专利技术实施例8中质粒标准品的荧光定量PCR结果图，从左至右，每一条曲线代表的标准阳性质粒浓度依次为100～108。图9是本专利技术实施例8中质粒标准品标准曲线图，其中X轴为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物与探针，其特征在于，所述引物如下：上游引物：5’‑CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA‑3’；下游引物：5’‑GATCCTTGTATTCCACCGATG‑3’；所述探针为：5'‑FAM‑AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA‑BHQ1‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物与探针，其特征在
于，所述引物如下：
上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；
下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；
所述探针为：
5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。
2.权利要求1所述的引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋
体的试剂盒方面的应用。
3.含有权利要求1所述引物与探针的试剂或试剂盒。
4.一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于，所述
试剂盒包括：权利要求1所述的PCR引物与探针、阳性对照、阴性对
照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永国，丁壮，龚悦，金雪敏，张文龙，吴殿君，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22