一种检测裂谷热病毒的引物和探针制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种应用RPA技术检测裂谷热病毒的引物及探针，其正向引物的序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2所示，探针序列为SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术根据裂谷热病毒基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出可快速有效检测裂谷热病毒核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以体外转录的裂谷热病毒核酸RNA作为阳性对照可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体和蓝舌病病毒为模板进行反应均没有扩增曲线。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医病原微生物检测
，具体涉及一种检测裂谷热病毒的引物 组和探针。即应用重组酶聚合酶等温扩增技术（RecombinasePolymeraseAmplification， RPA)技术检测裂谷热病毒所用到的引物及检测方法。
技术介绍
裂谷热（Riftvalleyfever，RVF)是由裂谷热病毒（Riftvalleyfever virus，RVFV)引起反刍动物和人发病的人兽共患病。裂谷热病毒可以通过蚊子或接触血液、 体液、组织或患病动物而传播。本病对绵羊、山羊、牛的影响较为严重，可引起怀孕动物的流 产和新生畜的死亡。大龄非怀孕动物也较易感，但临床抗病性较强，动物的易感性与其本身 的遗传差异有关，来自非洲以外及RVF非流行地区的动物对本病较易感。人对RVFV易感， 可通过接触、处理感染性材料或通过蚊虫媒介叮咬感染，人感染后通常无症状或者与主要 的自身限制性的发热疾病相关。经过2 - 5天的潜伏期之后，病人可能经历一个流感样的 疾病，伴随无显著特点的疲劳，低烧，头疼，畏光和关节疼痛。一些病人发展为昏倒。大量有 症状的病人将呈现肝炎。发热通常持续一周，大部分自然康复，少于5%的病人将发展为综 合征如肾炎、出血热或者脑炎，死亡率高达10 - 12%。 裂谷热主要在西非和其他一些非洲国家呈地方性流行，在强降雨后牲畜和人群中 周期性流行。2000年病毒被传播到阿拉伯半岛，引起沙特和也门的疫情大暴发，这也是该病 第一次被传播到在非洲大陆以外的地方，提示该病进一步扩散到其他地区的可能性进一步 增大。目前已经建立了几种实时荧光RT-PCR方法来检测该病，但这些方法普遍需要高昂的 仪器设备，并且无法满足田间检测的需要。为快速对裂谷热做出诊断，急需建立一种使用易 读取系统基础之上的高灵敏性和特异性的实时检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用RPA技术检测裂谷热病毒的引物及探针，从而弥补 现有技术的不足。 本专利技术的引物及探针，其正向引物的序列为SEQIDNO:1，反向引物序列为SEQID NO: 2所示，探针序列为SEQIDNO: 3所示。 其中探针RVFV-RPAp中的第27个碱基标记BHQl淬灭基团修饰，第28位碱基替换 为四氢咲喃（tetrahydrofuran)，第29位碱基标记FAM发光基团修饰，3'末端进行磷酸化 修饰。本专利技术的引物及探针用于检测裂谷热病毒； 本专利技术还提供了一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测裂谷热病毒的方法：提 取待检样品中的RNA作为模板，利用所述的引物和探针进行荧光快速检测，如果有明显的 荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有裂谷热病毒核酸。 本专利技术根据裂谷热病毒基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出可快 速有效检测裂谷热病毒核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以体 外转录的裂谷热病毒核酸RNA作为阳性对照可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口 蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体和蓝舌病病毒为模板进行反应均没有扩增曲线。【附图说明】 图1为裂谷热病毒特异性检测，其中1为裂谷热病毒阳性对照，2-6分别为口蹄疫 病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体、蓝舌病病毒和健康羊淋巴结。 图2为检测灵敏度试验图，使用体外转录的RVFVRNA为模板，拷贝数从IO6到10° 低依次的检测阳性率。【具体实施方式】 本专利技术通过对RVFV毒株进行序列比对后，获得病毒保守性较高的区域，然后从该 区域设计引物及探针。所使用的引物和探针若检测出特异性荧光曲线则为RVFV毒株。 下面通过【具体实施方式】的详细描述进一步阐明本专利技术。对于本专利技术具体实施例中 所采用的方法步骤，本领域的普通技术人员可以从现有技术中进行选择替换，而并不仅限 于本专利技术的具体记载。 实施例I :RPA检测RVFV方法的建立 根据GenBank中裂谷热病毒基因组序列，设计引物和探针。引物长度约为 30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本专利技术前期工作过程中设计合成了大量 引物，从中筛选出一对灵敏度高且特异性好的引物，引物和探针序列SEQIDNo. 1、SEQID No. 2、和SEQIDNo. 3(表 1)。 表1:用于RPA检测RVFV的引物和探针注：RVFV-RPAf中的K代表G或T，RVFV-RPAr中的Y代表T或C。RVFV-RPAp中的 第27个碱基标记BHQl淬灭基团修饰，第28位碱基替换为四氢呋喃（tetrahydrofuran)，第 29位碱基标记FAM发光基团修饰，3'末端进行磷酸化修饰。 对于本专利技术设计的引物的灵敏度和特异性进行检测，具体步骤及结果如下： 1 ?材料与方法 (1)材料人工合成的裂谷热病毒DNA、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、羊支原体和羊传 染性脓疱病毒，以及健康羊淋巴结样品。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成，其 他试剂均为进口分装或国产分析纯。 (2)病原核酸提取取200y1病原培养物或经2000g离心后的组织匀浆液，使用 Roche公司的HighPurePCRTemplatePreparationkit按照产品说明书提取各种材料中 的总核酸。 (4)体外转录制备裂谷热病毒模板将人工合成的裂谷热病毒Sudan30_2010株 (JQ820481)扩增目标基因连接到pGEM-T载体上，单酶切成线性质粒，然后按照Riboprobe InvitroTranscriptionsystems的说明书进行体外转录，产物经DNaseI消化、3M的醋 酸钠乙醇沉淀后，溶解于无RNase的水中，测定浓度后计算出对应拷贝数，依次从IO6拷贝/ y1以10倍倍比稀释至10°个拷贝/y1。-70°C保存。 (3)RPA扩增使用TwistAmpexo(TwistDx，Cambridge，UK)试剂盒在 50y1 反应体 系进行RPA试验，首先在I. 5ml离心管中加入再水化缓冲液29. 5y1，Transcriptor反转录 酶（Roche)O. 5y1，10yM的引物各 2.Iy1，10yM的TwistAmpexo探针 0? 6y1，模板RNA 和dH20 12. 7y1，涡旋混匀短暂离心后，将前述混合液加入到RPA冻干酶球的反应管中，加 入280mM的醋酸镁溶液2. 5y1，混匀，将反应管置于RPA扩增检测仪（Twista)或荧光定量 PCR仪中，37°C反应15分钟。以不同种类的病原核酸和健康羊总核酸为模板进行特异性检 测，以不同稀释度的RNA标准为模板进行反应的灵敏性检测。 2?结果 2. 1特异性结果用本专利技术所设计的引物和探针进行快速检测，以裂谷热病毒核酸RNA为模板均可 以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体、蓝 舌病病毒和健康羊淋巴结总核酸为模板进行RPA反应均没有扩增曲线（图1)。 2. 2灵敏性结果 将病毒核酸10倍稀释至多个梯度，每个梯度重复10次检测，使用统计软件计算出 在模板低至约1〇〇个拷贝时有95%的检出率，具有高灵敏度（图2)。 实施例2RPA检测技术在临床样品中的检测应用 使用实施例1中建立的方法，在2014年7月至9月期间对国内云南、广西和广东 等三省送检的30份羊口鼻拭本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物及探针，其特征在于，所述的引物中的正向引物的序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2，探针序列为SEQ ID NO：3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，吴晓东，刘春菊，邹艳丽，王华，王清华，王志亮，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37