本发明专利技术公开了用于检测EGFR基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒，其探针和引物为SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 24，本发明专利技术(1)最大程度地提高了扩增效率；(2)灵敏度高，检测灵敏度可达2‰；(3)与数字PCR方法比较，操作简单，节约成本，临床应用范围广；(4)大反应体积血浆样本检测，使血浆样本DNA上样量变大，体系更稳定，增大了血浆样本的检出率；(5)在3个反应管内可同时检测EGFR基因的25种突变，结果直观明了(6)检测速度快，耗时仅需数字PCR的二分之一；(7)本发明专利技术检测方法能够检测外周血标本，采样方便，可动态监测患者使用EGFR-TKI药物的疗效。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种表皮生长因子（EGFR)基因突变检测 的探针、引物、检测体系及试剂盒。
技术介绍
表皮生长因子受体基因位于人类7号染色体的短臂上，由188307个碱基组成，包 括28个外显子。其酪氨酸激酶功能区由外显子18~24编码。表皮生长因子受体（EGFR) 是原癌基因C-erbB-l(HER-l)的表达产物，定位于细胞膜上。EGFR主要通过两条途径将信 号传递至细胞核，一条是Ras-Raf-MAPK途径；另一条是PI3K-PKC-IKK途径。当 信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信号传导的 异常是导致多种肿瘤发生的原因。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs)是针 对EGFR靶点的小分子抑制剂，多项临床试验已证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从 EGFR-TKIs显著获益。EGFR基因编码区的突变主要发生在外显子18~21上。目前已发现 至少30种突变与EGFR-TKIs药物反应性有关，主要是外显子19的缺失突变和外显子21的 L858R突变。此外，大部分患者在服用EGFR-TKIs-段时间后会出现耐药，其中约60%耐药 患者可检测到EGFR20号外显子T790M突变。外显子18、19、20、21突变约占EGFR基因突 变比例分别为5%、45 %、1 %和45%。目前肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主 要来源，但部分晚期肺癌患者已无法得到肿瘤组织样本。研究发现肺癌患者的外周血中存 在来源于凋亡、坏死的肿瘤细胞的游离DNA。因此，血浆样本也可用于肺癌患者EGFR基因突 变状态的检测。血浆样本EGFR突变状态的检测，既可以预测患者服用EGFR-TKIs治疗的疗 效，也可以在EGFR-TKIs治疗过程中连续、动态监测EGFR突变状态变化，用于指导患者的治 疗。 目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法，这两种方法均存在一 定的缺陷。测序法灵敏度较低约20%，且操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高。ARMS-PCR 方法能够达到1 %的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血 液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1 %，ARMS-PCR方法灵 敏度不足以对血液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过 程中可能会产生耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此，从这些低 含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的 突变检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高灵敏度检测EGFR基因突变的试剂盒。 在本专利技术的一方面，提供一种检测EGFR基因突变检测的引物和探针，其特异引物 与探针包括如下序列： 表1EGFR突变基因特异性双引物和探针核苷酸序列 本专利技术另一方面提供一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括： P-EGFR混合酶、P-EGFR阳性对照和P-EGFR反应液A、B。反应液内包含相应的EGFR基因 突变检测和内控检测试剂，突变由FAM/R0X/CY5信号指示，内控由HEX信号指示，内控作为 结果判读的一部分，选择的检测区域是人类EGFR基因相对保守的区段，用于监控血浆样本 DNA质量和PCR反应过程。 表2试剂盒组成 表3试剂盒不同反应管检测的突变类型 本专利技术另一方面提供一种用于检测EGFR基因突变的PCR反应扩增体系如下： 19DEL&L858R体系： T790M体系 G719XS768IL861Q体系： 本专利技术再一方面，提供一种检测EGFR基因突变的方法（所述方法用于非诊断目 的），所述方法包括以下步骤： (1)根据COSMIC数据公布的人类EGFR为野生型基因序列，针对EGFR25种基因突 变，设计特异性引物和探针。 (2)提取血浆检测样本中的DNA。 (3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。 (4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：利用特异性引物和荧光探针 进行PCR检测，突变由FAM/R0X/CY5信号指示，内控由HEX信号指示，通过计算ΛCt的大小 进行判断，反应管的ACt值<ACtCut-off值时，则样品为该反应管对应信号突变阳性， 反之则为阴性或低于试剂盒的检测下限。 ΔCt值一Ct值 FAM/R0X/CY5-Ct值HEX/VIC 表4结果判定 本专利技术基于ARMS-PCR平台，开发一种高灵敏度检测EGFR25种基因突变的试 剂盒。本试剂盒以血浆DNA为检测样本，通过检测EGFR基因突变，既可以预测患者服用 EGFR-TKIs治疗的疗效，也可以在EGFR-TKIs治疗过程中连续、动态监测EGFR突变状态变 化，用于指导患者的治疗。本检测方法灵敏度高，检测时间只需140分钟即可完成，同时具 备了特异性好，准确率高，价廉快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。 本专利技术的有益效果是：本专利技术采用了特异性引物和探针技术，可以实现血液样本 EGFR25种基因突变的快速检测。本专利技术（1)由于早期肿瘤释放到外周血中的游离DNA极其 微量且呈高度片段化，故引物设计上，（i)控制扩增产物长度在l〇〇bp左右，并且控制引物 的Tm值在65°C左右；（ii)本试剂盒在特定buffer体系下，直接用突变特异引物进行富集 和放大，最大程度地提高了扩增效率；（2)灵敏度高，检测灵敏度可达2%。； (3)与数字PCR 方法比较，操作简单，节约成本，临床应用范围广；(4)大反应体积血浆样本检测，使血浆样 本DNA上样量变大，体系更稳定，增大了血浆样本的检出率；（5)在3个反应管内可同时检 测EGFR基因的25种突变，不同外显子上的突变采用不同荧光信号进行区分，结果直观明 了（6)检测速度快，检测过程只需要120分钟即可完成，耗时仅需数字PCR的二分之一；（7) 本专利技术检测方法能够检测外周血标本，采样方便，可动态监测患者使用EGFR-TKI药物的疗 效。【附图说明】 图1为1#管FAM信号（19-del)灵敏度分析试验结果PCR图； 图2为1#管R0X信号（L858R)灵敏度分析试验结果PCR图； 图3为2#管FAM信号（T790M)灵敏度分析试验结果PCR图； 图4为3#管FAM信号（G719X)灵敏度分析试验结果PCR图； 图5为3#管R0X信号（L861Q)灵敏度分析试验结果PCR图； 图6为3#管CY5信号（S768I)灵敏度分析试验结果PCR图； 图7为1#管临床样本FAM信号阳性PCR图； 图8为1#管临床样本R0X信号阳性PCR图； 图9为1#管临床样本FAM信号阴性PCR图； 图10为1#管临床样本R0X信号阴性PCR图； 图11为2#管临床样本FAM信号阳性PCR图； 图12为2#管临床样本FAM信号阴性PCR图； 图13为3#管临床样本FAM信号阳性PCR图； 图14为3#管临床样本R0X信号阳性PCR图； 图15为3#管临床样本CY5信号阳性PCR图； 图16为3#管临床样本FAM信号阴性PCR图； 图17为3#管临床样本R0X信号阴性PCR图； 图18为3#管临床样本CY5信号阴性PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测EGFR基因突变的探针、引物，其特征在于，包括如下序列：引物名称序列序号E‑19‑M2‑SGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGACATCTSEQ ID NO：01E‑19‑M7‑SAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCTCCSEQ ID NO：02E‑19‑M11‑STTCCCGTCGCTATCAAGGAGCASEQ ID NO：03E‑19‑M14‑SAATTCCCGTCGCTATCAAGGAACCSEQ ID NO：04E‑19‑M12‑SGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAGCSEQ ID NO：05E‑19‑RCACAGCAAAGCAGAAACTCACATSEQ ID NO：06E‑19‑P‑CFAM‑5′‑CCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTC‑3′‑BHQ1SEQ ID NO：07E‑19‑blockGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCCT‑3′‑NH2SEQ ID NO：08E‑21‑M1‑FGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGSEQ ID NO：09E‑20‑M2‑FGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGSEQ ID NO：10E‑20‑M2‑RGCACACGTGGGGGTTGTCCACGASEQ ID NO：11E‑20‑M2‑P‑CY5CY5‑CCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGC‑BHQ2SEQ ID NO：12E‑21‑M2‑SGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACASEQ ID NO：13E‑21‑RGTCAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGSEQ ID NO：14E‑21‑P‑C‑ROXROX‑CCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGA‑BHQ2SEQ ID NO：15E‑18‑M‑FFGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGASEQ ID NO：16E‑18‑M1‑FRTATACACCGTGCCGAACGCACCGGAGGSEQ ID NO：17E‑18‑M3‑FRCCGTGCCGAACGCACCGGAGCASEQ ID NO：18E‑18‑M3‑FPFAM‑CCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTT‑BHQ1SEQ ID NO：19E‑18‑block‑FTGCCGAACGCACCGGAGCC‑3′‑NH2SEQ ID NO：20E‑20‑M1‑FCCTCACCTCCACCGTGCARCTCATCATSEQ ID NO：21E‑20‑RGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGSEQ ID NO：22E‑20‑P‑CFAM‑CTCATGCCCTTCGGCTGCCTCC‑BHQ1SEQ ID NO：23E‑20‑M1‑BlockCCTCACCTCCACCGTGCARCTCATCACCA‑NH2SEQ ID NO：24。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江风阁，林清华，陈婷，宋庆涛，阮力，朱冠山，郑立谋，
申请(专利权)人：厦门艾德生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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