一种用于检测C‑kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测C‑kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒。所述的引物和探针及试剂盒包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C‑kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针。所述的试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒成本低等显著优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
C-kit原癌基因位于4号染色体长臂，基因全长约80kb，由21个外显子组成。C-kit的mRNA长5185bp，其开放式阅读框长2931bp，编码976个氨基酸残基的跨膜蛋白分子，即跨膜酪氨酸激酶受体C-kit蛋白。KIT蛋白分子量为145kD左右，是Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受体家族成员，由含五个Ig样基序的胞外区(结合配基，1-519位氨基酸)、较短的跨膜区(传导信号，520-543位氨基酸)和含酪氨酸激酶活性的胞浆区(544-976位氨基酸)组成。C-kit基因异常在肢端和粘膜部位黑素瘤中最常见。这些特点为黑素瘤个体化治疗奠定了理论基础。高加索人种黑素瘤中BRAFV600E突变率最高，最近开发的多种针对突变的向药物，在部分临床试验中己经取得了令人鼓舞的疗效。而亚洲人种与高加索人种不同，其最主要的黑素瘤类型是肢端黑素瘤，这一类型黑素瘤最显著的异常基因是C-kit基因，其中与C-kit基因相关的传导路径SCF/C-kit途径是指当与其配体干细胞生长因子(SCF)结合后，引起C-kit同源二聚体化及胞装区的酪氨酸激酶活化，使得特定酪氨酸发生自酸化，通过PI3K-AKT途径活化，从而来调控细胞生长、增殖、凋亡、迁移及粘附。目前认为SCF/C-kit途径在人类恶性肿瘤中的作用机制主要包括以下两个方面：1.C-kit基因异常导致不依赖SCF配体的C-kit受体活化；2.SCF的自分泌和旁分泌途径对C-kit受体的异常刺激。现己在胃肠间质瘤(Gastrointestinalstromaltumor,GIST)、白血病、神经母细胞瘤等多种肿瘤发生过程中发现存在C-kit的持续活化，并且酷氨酸激酶抑制剂-甲酸伊马替尼也己成功运用于GIST的临床治疗中。已经明确大部分GIST的kit基因蛋白可获得性功能突变表达蛋白CD117，从基因方面上，大部分的GIST均存在C-kit基因的活化突变，并保持独立性传导激活。即C-kit蛋白可以在无任何配体相结合的情况下保持持续性的激活自身酪氨酸激酶，从而导致人肥大细胞增生，最终形成人肥大细胞增生病和GIST的发生。随着人们对GIST基因突变研究的不断深入，C-kit基因突变直接涉及到GIST的发生、发展，因此，C-kit基因突变已经成为GIST发生的主要机制。对于病变局限、可手术切除的GIST，仍首选外科手术R0切除。对于术后复发、转移，无法完全切除的患者，分子靶向药物甲磺酸伊马替尼的应用为其提供了全新的治疗方案。GIST中C-kit基因突变率约为80％-90％，突变形式多样，包括替换、缺失和插入重复等。其中位于外显子11Lys550-Va1560区段的突变最为常见(约70％-80％)，位于外显子9Ala502-Tyr503区段的6碱基插入重复突变约占5-10％。目前，检测C-kit基因突变的主要方法有DNA直接测序法、高分辨率溶解曲线法、ARMS-PCR法。然而，直接测序法灵敏度低，检测灵敏度只有20％-30％，低灵敏度的检测会导致漏检及假阴性的发生。此外，直接测序法实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。高分辨率溶解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院普及。较为先进的C-kit基因突变检测技术是采用扩增突变阻滞系统(AmplificationRegractoryMutationSystem,ARMS)衍生的系列技术。ARMS-PCR是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法，其依据的基本原理是:TaqDNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3′末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模板DNA没有与引物3′末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板DNA上具有与引物3′末端相应的突变。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关(AyyadevaraS,ThadenJJ,ShmooklerReisRJ,AnalBiochem2000；284:11-18),还与样本中存在的等位基因变量的影响。为了增加ARMS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证明，该方法最关键的是设计与3’末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克服，如报道的在3’倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准，会出现混乱的情况，见[JVirolMethods.2008Nov；153(2):156-62；Genomics.2004Feb；83(2):311-320]。简单的ARMS-PCR通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应条件来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR污染的机会，而且耗时费力。尽管有人对该方法做了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是“全或无”式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了△Ct的概念，即△Ct＝野生Ct-突变Ct，并为△Ct值设定一个阈值，如要△Ct值大于阈值判为突变型纯合子，△Ct值小于阈值判为杂合子，△Ct值为负数，则判为野生型纯合子，△Ct值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为△Ct值的设定标准无法准确定位，不同的标本和不同的检测仪器都会有不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用也很受限。目前，全球只有许多家企业拥有ARMS相关衍生技术和产品：如Scorpins-ARMS是英国Dxs公司开发的试剂盒，检测灵敏度高，性能稳定。该试剂盒采用探针为Scorpion探针，Scorpion探针是一种新型的探针，由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5’端和3’端分别有报告荧光和淬灭荧光，3’端通过PCRblocker(一个非扩增的单体，防止探针退火后的延伸)与引物的5’端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模版结合并延伸，环区与新合成的目的基因的互补区域结合，此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上，是分子内的结合。由于发夹结构打开，报告荧光和淬灭荧光分离，因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。但是该试剂合成本太高，每份标准需要3000-5000元，不适合广泛推广使用。国内厦门艾德生物医药有限公司属于生产ARMS基因检测试剂盒的行业巨头，但没有C-kit基因K642E突变检测试剂盒。北京鑫诺美迪基因检测技术有限公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测C‑kit基因K642E突变位点的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C‑kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针选自序列表中SEQ ID NO.01～SEQ ID NO.05所示的任一条；所述用于检测C‑kit基因K642E突变位点的探针选自序列表中SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15所示的任一条；所述质控探针如序列表中SEQ ID NO.18所示；所述用于检测C‑kit基因K642E突变位点的探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团；所述质控探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测C-kit基因K642E突变位点的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针包含用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针、用于特异性扩增靶向序列的上游引物、用于特异性扩增靶向序列的下游引物、用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针、质控引物对以及质控探针；所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针选自序列表中SEQIDNO.01～SEQIDNO.05所示的任一条；所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针选自序列表中SEQIDNO.12～SEQIDNO.15所示的任一条；所述质控探针如序列表中SEQIDNO.18所示；所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团；所述质控探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭报告基团。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述用于阻断野生型基因扩增的肽核酸PNA探针5’端连接有H2N-基团，3’端连接有-CON2H基团。3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述用于检测C-kit基因K642E突变位点的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM基团，3’端连接的淬灭报告基团为MGB基团。4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述质控探针5’端连接的荧光报告基团为HEX基团，3’端连接的淬灭报告基团为MGB基团。5.根据权利要求1所述的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，王硕，张晓飞，张凤龙，
申请(专利权)人：西安医臻生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61