粳稻的ALS突变型基因及其蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种粳稻的ALS突变型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第406位核苷酸由G变成核苷酸T。本发明专利技术还公开了一种粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变蛋白及其应用。该突变蛋白来源于抗ALS抑制剂类除草剂的粳稻突变体植株，与粳稻的野生型ALS序列相比，其蛋白序列在Gly136位点发生突变。绿色植物表达该蛋白序列可以抗（耐）乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，特别是咪唑啉酮类除草剂。

【技术实现步骤摘要】
粳稻的ALS突变型基因及其蛋白和应用
本专利技术属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本专利技术涉及粳稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本专利技术公开了该突变蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
技术介绍
乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC4.1.3.18)，是植物和微生物3种氨基酸生物合成过程中的关键酶。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白的合成，最终导致植物生长受阻，直至死亡。因此，以ALS为作用靶标开发了多种高效除草剂，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。这些除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂，这类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂属于选择性除草剂，在杀草的同时，也会对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。ALS属于依赖硫胺素焦磷酸酶的家族，在植物、真菌以及藻类等体内均已被发现。该酶由催化亚基和调节亚基构成，催化亚基分子量约为65kD，调节亚基在9-54kD之间。对于实现ALS的全酶活性，除了这2个亚基之外，还依赖于3个必不可少的辅助因子，ThDP、二价金属离子和黄素嘌呤二核苷酸。成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。而且，不同位点的氨基酸残基变异产生不同类型的ALS抑制剂类除草剂抗性。其中，水稻已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Gly95、Ala96、Ala122、Trp548、Ser627、Ser653和Gly654。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。有些研究还表明，氨基酸变异引起的ALS突变酶对抑制剂类除草剂产生抗性的同时，有些ALS突变酶的酶学特性也有所改变。目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。而且目前国内外均没有人研究报道关于粳稻的乙酰乳酸合成酶的突变否会产生除草剂抗性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种粳稻的ALS突变型基因。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变蛋白。本专利技术还要解决的技术问题是提供了含有上述的粳稻的ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。本专利技术还要解决的技术问题是提供了上述粳稻的ALS突变型基因、突变蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术人通过对粳稻品种镇稻18号植株进行长期、不断地EMS突变的筛选，发现了一个新的ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本专利技术在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，本专利技术还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因水稻中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种粳稻的ALS突变型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第406位核苷酸由G突变为T。上述粳稻的ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。上述的粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变型蛋白。该突变来源于粳稻品种镇稻18，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型水稻粳稻ALS(如Genbank登录号XM_015770973.1)相比，其在氨基酸在Gly136位点突变。目前还没有报道表明，在来自水稻粳稻的ALS的Gly136位点突变，会使得粳稻具有ALS抑制剂类除草剂抗性。上述的粳稻的ALS突变蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的粳稻的ALS突变型基因。本
技术实现思路
还包括上述的粳稻的ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。上述绿色植物为水稻等。本
技术实现思路
还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：1)使绿色植物包含所述的粳稻的ALS突变型基因；或2)使绿色植物表达所述的粳稻的ALS突变型蛋白。上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：1)测定所述绿色植物是否包含上述的粳稻的ALS突变型基因；或，2)测定所述绿色植物是否表达上述的粳稻的ALS突变型蛋白。有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本专利技术的粳稻的ALS突变蛋白的植物3-4叶幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型粳稻3-4叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。附图说明图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻粳稻突变体；图2PCR扩增粳稻镇稻18突变体的ALS基因结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为镇稻18野生型水稻DNA，第3泳道为抗除草剂镇稻18突变植株的DNA；目的片段长度1935bp；图3为百垄通除草剂对野生型和抗除草剂突变植株的ALS酶活性抑制；图4百垄通除草剂对野生型和抗除草剂镇稻18突变体植株的ALS酶活性抑制的吸光值测定；图5突变体植株的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后产生的基因片段和质粒片段DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粳稻的ALS突变型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第406位核苷酸由G突变为T。

【技术特征摘要】
1.一种粳稻的ALS突变型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第406位核苷酸由G突变为T。2.根据权利要求1所述的粳稻的ALS突变型基因，其特征在于，所述ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。3.权利要求1或2所述的粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变型蛋白。4.根据权利要求3所述的粳稻的ALS突变型蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1或2所述的ALS突变型基因。6.权利要求1或2所述的ALS突变型基因、权利要求3或4所述的ALS突变型蛋白，权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。7.根据权利要求6所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保龙，王金彦，陈天子，凌溪铁，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32