本发明专利技术公开了检测STMN1mRNA表达量的引物、Taqman探针和试剂盒，其中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。该引物及探针灵敏度高、特异性好，由其组成的试剂盒操作简便安全，且整个检测过程只需要80min，节省时间，对于新鲜冰冻组织、石蜡包埋组织、血液等样本均具有较高的灵敏度和特异性，适用范围广，相对定量采用双标准曲线方法，误差相对较小，结果更加准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及检测STMNl mRNA表达量的引物、Taqman 探针和试剂盒。
技术介绍
微管不稳定蛋白（STMNl)是一种高度保守的细胞内可溶性磷酸蛋白质，在细胞周 期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用来调节细胞微管系统的动力学平衡，控制细胞周 期，改变细胞的增殖、分化等生物学行为。其对于微管的调节作用是有丝分裂中纺锤体形成 的重要保障，因而也成为了抗微管类药物的直接靶点。 抗微管类药物是通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成，并抑制细胞有丝分裂的 一类广谱化疗药。临床上被广泛应用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、食 管癌等。目前常用的抗微管类药物主要为紫杉烷类和长春碱类，紫杉烷类包括紫杉醇、多西 他赛，主要通过促进肿瘤细胞内的微管聚合以及稳定已聚合的微管，导致细胞内大量微管 聚集，进而干扰细胞各种功能，特别是使细胞停止分裂；长春碱类包括长春碱，长春新碱和 长春瑞滨等，它们可以抑制肿瘤细胞内微管蛋白的聚合、抑制纺锤体微管的形成，使核分裂 停滞于细胞分裂中期，从而抑制肿瘤细胞生长。STMNl通过促进微管的解聚或阻止微管的聚 合从而影响有丝分裂纺锤体的形成，影响细胞的正常分裂。STMNl蛋白的表达情况直接影响 到抗微管药物的化疗活性，因而对于STMNl的检测有利于临床医生对于病人的个体化用药 选择。 从检测角度上来说，对于mRNA表达水平的检测主要有Nothern blot杂交、原位杂 交、RT-PCR以及近几年兴起的液相芯片法。Nothern blot和原位杂交由于操作复杂，对于 操作人员的技术要求较高，检测时间长等原因导致其应用受到限制；液相芯片法检测灵敏 度高，可同时检测多个指标，但是由于液相芯片法成本高，对于检测设备要求也高，因而推 广受到限制；而RT-PCR由于操作相对简单，检测时间短，检测设备在大多数医院都可以得 到满足，因而在临床上得到广泛的应用。 RT-PCR主要包括半定量PCR和定量PCR两种，而定量PCR又包含相对定量PCR和 绝对定量PCR。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经 过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。所谓相对定量是指在测定 目的基因的同时测定某一内源性基因，该基因的作用有：（1)用于核苷酸的拷贝数的比较； ⑵作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及 反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3)标准化标本。由于基因在各种组织中 是恒定表达的，所以可以以基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表 达量的差异。通常选用的基因有GAPDH、f3-ACTIN、B2M和rRNA，研究者也可以根据具体的 需要而选定合适的基因。 常用的相对定量可分为双标准曲线法和△ AC t法。相对定量较为早期使用的方 法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和基因的量，再将目 的基因的同基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和基因的扩增 效率一致。这种方法通量较低，但结果会更加准确。另一种是用AAC t方法进行相对定 量。△ AC t方法使用单一的样品（被称为校正样品）来比较未知样品的目标基因的表达。 校正样品在每个板上与未知样品同时分析。校正公式为：这里Δ AC t = -。校正样品是任何 被选做代表1倍目的基因表达量的样品。这一公式基于这样一种假设：目的基因的扩增效 率与看家基因的扩增效率相同，效率接近于1，并且目标基因扩增一倍其Ct值减少一个循 环。实际情况很少会与这一假设完全相符，然而，这种方法的优越性在于，由于无需在每个 板上对靶基因进行标准曲线分析使样品的通量得以增加，并且这一方法更有益于检测基因 表达的诱导或下调。 在临床上被广泛应用的是相对定量PCR，它可以准确检测出一个基因的相对表达 变化，从而为患者病情的诊断提供参考依据。相对定量PCR有两种检测方法，一种是SYBR green染料检测法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺 入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而 保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步；另一种是Taqman探针法，当探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探 针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完 全同步。SYBR green法操作简单，价格也比较便宜，灵敏度也相对较高，因而受到青睐，科学 研究中很多使用SYBR green法，但是由于SYBR green染料结合的是双链DNA，不具有特异 性，因此也比较容易出现假阳性的情况；Taqman法具有灵敏度高，特异性好的特点，因而在 临床上普遍采用这种方法，但是由于探针结合所需要的温度较高，因此探针的片段长度一 般也比较长，不利于找到所有排序序列的较短片段的保守区，此外，探针长度的增加也降低 了探针结合的效率，影响了检测结果的准确性。此外，常规Taqman探针法无法识别cDNA和 基因组的差别，无法避免在RNA提取过程中掺杂的基因组而导致产生假阳性的情况。
技术实现思路
为了克服现有技术检测能力的不足，本专利技术在Taqman探针法的基础上提供一种 具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度检测STMNl mRNA表达量的引物和Taqman探 针。 基于以上引物和探针，本专利技术还提供了一种操作方法简单的检测STMNl mRNA表达 量的试剂盒，尤其适用于检测患者肿瘤细胞中的STMNl mRNA表达量。 本专利技术提供的检测STMNl mRNA表达量的引物和Taqman探针，所述引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1~2所示，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；探针 5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。 优选地，Taqman探针为Taqman MGB探针。 本专利技术引物设计的原理是在STMNl基因的2、3号外显子上设计跨外显子的上、下 游特异性引物。上游引物的5'端和3'端分别设计在2号外显子和3号外显子上，并且上 下游引物之间隔了一个长达1000多bp的内含子，以及高特异性的MGB探针，故只能识别经 过剪切修饰的成熟的STMNl mRNA，而无法识别基因组中STMNl的序列，避免了在组织RNA提 取过程中混入少量基因组DNA而导致实验结果出现假阳性的情况。 另外，本专利技术优选采用Taqman-MGB探针，与普通的Taqman探针比较，MGB探针具 有两大特点：一是探针3'端标记了自身不发光的淬灭分子，以取代常规可发光的TAMRA等 荧光标记。这使荧光本底信号的干扰大大降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。二是探针 3'端增加了一个MGB。MGB可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度，一方面缩短 了探针长度，使荧光基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好；另一方面，也提高了探针 的特异性，使结果更精确，分辨率更高。 本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测STMN1mRNA表达量的引物和Taqman探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡利红，夏琦，吴志伟，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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