甲基化高通量检测方法技术

本发明专利技术提供一种甲基化高通量检测方法，特别提供了一种结合序列捕获和重亚硫酸盐测序的方法，该方法能够同时准确有效地分析几个样品中的目标区域甲基化状态，降低探针设计的难度，增加操作及应用的可行性，使得对全基因组内感兴趣的目标序列和区域进行高通量高精度的甲基化检测成为现实，并且该方法还具有针对性强以及节约成本和时间的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高通量基因组甲基化DNA检测领域，特别是提供了一种结合序列捕获和重亚硫酸盐(bisulfite)测序的方法。另外，本专利技术还涉及外显子组测序和基于重亚硫酸盐转换的甲基化分析测序
本专利技术还涉及甲基化标签(Index)接头技术，可以实现在一个芯片上同时进行几个样品的捕获。本专利技术的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。
技术介绍
DNA甲基化是表观遗传学研究领域最为热点的方向之一，也正逐渐成为哺乳动物发育和癌症等多种疾病的表观遗传学标记。DNA甲基化不仅对染色质结构修饰，基因组稳定性具有重要作用，而且在真核生物中，DNA甲基化参与多种生物学过程，如胚胎发育，基因组印记，X染色体失活，基因表达的调节与沉默，逆转录转座子的沉默以及哺乳动物肿瘤等多 种疾病的发生(Brena RM et al. 2006 ；Egger G et al. 2004 ；Gu H et al. 2010)。DNA 甲基化生物标记为多种疾病的早期评估包括对高危险个体的检测评估，提供大量参考信息。目前，外显子组测序和基于重亚硫酸盐转换的甲基化分析测序均已成熟。以Illumina Solexa、AB SOLiD和Roche 454为代表的第二代测序技术在近几年得到快速发展，成为基因组学研究的重要工具。第二代测序技术最大的特点是高通量，其可对数以亿计的DNA片段同时进行测序，目前一台高通量测序仪一次可产生高达300Gb的数据，相当于将一个人的全基因组测序100次，高通量测序是通过超声波或其他方法将基因组打断成一系列的小片段，并在小片段的两侧加上接头(adaptor)，然后通过接头引物进行桥式PCR或乳液PCR(emulsion PCR)扩增形成测序的基本单位，再根据接头上的部分序列设计公共测序引物，对基因组DNA进行测序。当前研究DNA甲基化的方法主要有基于PCR的甲基化分析方法、基于限制性内切酶的甲基化分析方法、基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层析法等。重亚硫酸盐处理结合高通量测序是研究甲基化最常用也是最准确的方法，重亚硫酸盐测序法(bisulfite genomics sequencing)是利用重亚硫酸盐将基因组DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)修饰为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(C)保持不变，在PCR扩增中，尿嘧啶(U)将变成胸腺嘧啶(T)，因此甲基化位点就成为一个普通的C/T单碱基多态性位点，其中等位基因胞嘧啶(C)的频率即为基因甲基化的程度，该方法具有数据量大，成本高的缺点。结合高通量测序的还有甲基化DNA免疫共沉淀(Methylated DNA Immunoprecipitation,MeDIP)和甲基化CpG结合域(methyl-CpG binding domain,MBD)柱层析法,它们虽然能很好的对富含甲基化区域进行富集，但是覆盖度相对均一，缺乏针对性。序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术，其通过合适的方法将感兴趣的区域从基因组中分离出来，然后再对该目标区域进行测序，这对于低成本地有针对性的基因组学研究有非常重要的意义。最近研究发现(BrenetF et al. 2011 ；Harder A et al. 2010 ；Suzuki MM etal. 2008):外显子甲基化密度比之前认识到和期望的更为普遍，而第一个外显子和第一个内含子甲基化分布跟下游的外显子和内含子甲基化分布差异较大，大多下游区域甲基化的程度跟基因表达并非密切相关。总之，转录起始位点周围甲基化，第一个外显子区域甲基化与基因沉默的关系比上游启动子区域甲基化与之得关系更为密切。分析外显子甲基化对基因表达的研究有重大意义。现有研究大多是将基因组重亚硫酸盐处理后，根据c —T转换，设计特定的目标区域的探针，捕获靶区域甲基化的片段。这种方法在序列捕获之前将基因组进行重亚硫酸盐处理，增加了探针设计的难度及降低序列捕获的效率、目的区域的覆盖度，从而限制了应用的广泛性。
技术实现思路
针对上述基于重亚硫酸盐的甲基化研究方法中存在的问题，本专利技术提出了一种结合序列捕获和重亚硫酸盐测序的方法，该方法能够通过一次序列捕获试验对几个样品中的目标区域进行捕获，能准确有效地分析目标区域甲基化状态，降低探针设计的难度，增加操作及应用的可行性，使得对全基因组内感兴趣的目标序列和区域进行高通量高精度的甲基化检测成为现实，并且该方法还具有针对性强以及节约成本和时间的特点。本专利技术涉及的目的区域是外显子区域，将外显子组捕获与重亚硫酸盐测序相结 合，以此来检测人类全基因组外显子组的甲基化分布情况，这对研究发现外显子对基因表达调控的作用具有广泛的应用价值。该技术主要流程先将基因组DNA随机打断，加上特定接头后用液相杂交方法进行序列捕获，捕获下来的DNA内加入外源DNA然后再进行重亚硫酸盐处理，对处理好的DNA进行PCR扩增，TA克隆检测重亚硫酸盐处理效果，然后对文库进行定量检测及用新一代测序仪进行高通量测序，最后进行特异性区域范围内高精度的甲基化状况分析。该技术方案主要由以下五部分组成序列捕获探针的选择、文库制备、序列捕获、重亚硫酸盐处理、上机测序及数据分析。+序列捕获探针的选择本技术方案中探针设计简单，可以基于目前液相或者固相芯片杂交技术设计探针，探针长度可以从60mer-120mer不等。如选择探针SureSelect Human All Exon 38Mkit (Agilent)，该探针覆盖了人全外显子区域及部分miRNA区域，与基因组目的区域内其中一条链互补，平均长度为120mer。+文库制备步骤一样品基因组DNA以及外源基因组DNA的片段化起始目的研究材料和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种(例如人，植物，昆虫)的基因组DNA，利用物理或化学方法如超声波片段化方法将基因组DNA打断为200-300bp的片段。外源基因组DNA优选地选择没有甲基化修饰的XDNA，其作用是在重亚硫酸盐处理时与样品一起高效共处理，对微量的DNA片段起到保护作用，最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏。取没有蛋白、RNA等污染的完整基因组DNA约5 Ug以及作为外源基因组的X DNA，通过超声片段化方法将基因组DNA打断为大小200-300bp的片段。步骤二基因组DNA的末端修饰随机打断后的DNA回收纯化后，通过T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase) ,Klenow片段(Klenow Fragment)和T4聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase)等酶的作用进行末端修复，形成平末端的DNA片段。然后利用Klenow片段(Klenow Frgment) (3，-5’exo_)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基。步骤三PEI (Paired-end Index)甲基化接头(Adapter),也称为双末端标签甲基化接头的连接3’末端加上“A”碱基的序列在T4DNA连接酶(T4DNA Ligase)的作用下与特殊设计且甲基化修饰的接头(C位点甲基化修饰)进行连接，纯化回收，如用MiniElutePCR Purification Kit(Qiagen)回收纯化反应体系中的DNA后，对其进行定量，如采用Q本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基化高通量检测方法，其包括以下步骤：序列捕获探针的选择、文库制备、序列捕获、重亚硫酸盐处理、上机测序及数据分析，其特征在于序列捕获和重亚硫酸盐处理在文库制备的接头连接步骤和PCR扩增及文库切胶纯化步骤之间进行。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗慧娟，吉冠玉，蒋慧，吴明枝，孙继华，吴仁花，王君文，高飞，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：