甲基化CpG岛的高通量测序检测方法技术

甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括：用修饰剂处理DNA样品，将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；所得片段用引物A和DNA聚合酶扩增，获得一端能够锚定接头引物C的片段；所得片段用引物B和DNA聚合酶扩增，获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和D的片段；所得片段用接头引物C、D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，获得扩增产物；扩增产物分离纯化，构成高通量测序文库、上机测序及数据分析。在高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增的同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，以富集甲基化CpG岛及构建高通量测序文库。

【技术实现步骤摘要】
甲基化CpG岛的高通量测序检测方法
本专利技术涉及利用高通量测序技术检测基因组中的甲基化CpG岛。
技术介绍
DNA甲基化是指在DNA上的胞嘧啶(C)的第5个碳原子上被甲基共价修饰成为5’甲基胞嘧啶(5mC)，它具有多种重要的生物学功能，包括转录调控，转座子沉默、基因印记和X染色体失活等，一直是分子生物学领域的一个研究热点。在包括人类在内的脊椎动物中，DNA甲基化修饰绝大多数发生在CpG位点上(CpG表示核苷酸对，其中鸟嘌呤(G)在DNA链上紧随C后)。CpG在脊椎动物基因组中的平均含量低于预期概率，但在基因组某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因启动子，在人类基因组中，约有3万个CpG岛，其中50％以上位于启动子，而60％以上的基因启动子含有CpG岛。启动子CpG岛一旦被甲基化将导致相应基因表达沉默，已有研究表明这种机制参与了多种生理过程的调控，包括X染色体失活、基因印记、胚胎干细胞分化、生殖细胞发育以及肿瘤的发生和发展。基因内和基因间的CpG岛可能是尚未鉴定的启动子。全面理解CpG岛甲基化的生物学功能需要系统和高效的检测技术。传统检测DNA甲基化的方法，包括限制性酶切、限制性酶切-PCR、甲基化特异性PCR，只能检测单个或少数位点。近年来，随着高通量测序技术的发展，人们开始能够系统地从全基因组水平了解DNA甲基化谱式。目前基于高通量测序技术的DNA甲基化检测方法包括：1)甲基化DNA免疫沉淀；2)甲基化CpG免疫沉淀和3)亚硫酸氢盐测序(BisulfiteSequencing)。前二者采用抗体或重组甲基化CpG结合蛋白捕获甲基化DNA，随后进行高通量测序，这两种方法只能对DNA甲基化状态进行半定量检测，其分辨率为100bp左右。亚硫酸氢盐测序的原理是亚硫酸氢盐处理能使得DNA上的C转变成为尿嘧啶(U)，而5mC则不受影响，因此随后进行高通量测序就可以得知DNA上的甲基化修饰情况。这种方法的分辨率精确到单个碱基，是DNA甲基化分析的金标准。2009年第一次报道了亚硫酸氢盐测序获得的单碱基分辨率人类全基因组甲基化图谱。但是，由于这种技术是对全基因组进行测序，费用非常高，阻碍其应用于大量样本的检测。随后有研究者提出了简化代表性亚硫酸氢盐测序(GuH，etal.Preparationofreducedrepresentationbisulfitesequencinglibrariesforgenome-scaleDNAmethylationprofiling.NatProtoc.20116(4)：468-81.)，这种方法通过Mspl酶切、跑胶、纯化步骤富集启动子及CpG岛区域，随后进行末端修复、加A、接头连接、片段选择纯化和PCR扩增等步骤构建测序文库，虽然比全基因组亚硫酸氢盐测序更加经济和高效，但是文库构建过程繁琐，需要大约5～6天时间，而且富集过程不能区分甲基化和非甲基化CpG岛，增加了测序成本。专利(高通量测序文库的构建方法及其应用，CN103103624A)利用特异性探针捕获包括CpG岛在内的目的片段，然后进行亚硫酸氢盐测序，但序列捕获和文库构建过程同样相当费时。因此，目前尚缺乏一种高效的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。
技术实现思路
本专利技术方法通过高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增，同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，得以高效地富集甲基化CpG岛及快速地构建高通量测序文库，是一种新颖、高效和经济的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。在第一方面，本专利技术提供了甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括下列步骤：步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段。DNA可以是任何包含脱氧核苷酸的聚合物。优选地，所述DNA样品为基因组DNA，来源于动物、植物和微生物中至少一种，优选所述动物为人和小鼠中至少一种。所述DNA样品可以来自人的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合；在一个优选的形式中，所述DNA样品来自人的血浆或血清游离DNA；任选地，所述DNA样品来自人的全血基因组DNA；任选地，所述DNA样品来自人的肿瘤细胞株；处理DNA样品的修饰剂在形成单链DNA的条件下修饰C，但不修饰5mC。可以采用亚硫酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐，优选地，修饰剂是亚硫酸氢盐。可以采用商品化试剂盒将DNA样品进行亚硫酸氢盐处理，任选地，可以采用MethylCodeBisulfiteConversionKit(Invitrogen)、EZDNAmethylation-GoldKit(ZYMO)或EpiTectBisulfiteKit(Qiagen)。步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合经过转换的DNA片段；优选地，除了CpG以外，引物A的3’端部分只包含C、A和T，本领域技术人员可以理解，CpG表示核苷酸对，其中鸟嘌呤(G)在DNA链上紧随C后。更优选地，引物A的3’端第二个核苷酸为C。优选地，引物A的3’端部分还可用于初步富集甲基化CpG岛，得以在步骤二中获得初步富集CpG岛且一端能够锚定接头引物C的目的片段，在步骤二中进行初步富集能够提高整体富集效率，但是仍需在步骤三中对甲基化CpG岛进行进一步富集以达到充分富集的目的。初步富集需要引物A的3’端部分具有一定的CpG频率或者C频率。优选地，其特征为中等CpG频率，其所述中等CpG频率是指引物3’端起前7个核苷酸中包含1个CpG；优选地，其特征为高C频率，其所述高C频率是指3’端起前5个核苷酸中至少包含3个C，优选3’端起至少连续3个核苷酸为C；任选地，其特征为高CpG频率，其所述高CpG频率是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG，此时也可选择不再在步骤三中对甲基化CpG岛进行进一步富集(见后)。其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，反向互补序列能够被接头引物C结合并进行PCR扩增。锚定是指其引物A能够通过其5’端部分将接头引物C通过PCR反应连接到待测目的片段上。优选地，引物A的5’端部分与接头引物C的3’端起前15～40个核苷酸序列相同。DNA聚合酶可以是任何合适的聚合酶，如Taq聚合酶、ExTaq、LATaqDNA聚合酶、AmpliTaq、AmplitaqGold、TitaniumTaq聚合酶、KlenTaqDNA聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、AccuprimeTaq聚合酶、PyrobestDNA聚合酶、Pfu聚合酶、Pfu聚合酶turbo、Phusion聚合酶、Pwo聚合酶、Vent聚合酶、VentExo-聚合酶、SequenaseTM聚合酶、9。NmDNA聚合酶、TherminatorDNA聚合酶、ExpandDNA聚合酶、rTthDNA聚合酶、DyNazymeTMEXT聚合酶、DNA聚合酶1、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Bst本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增所述经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述经过转换的DNA片段；其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述一端能够锚定接头引物C的目的片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增。步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。...

【技术特征摘要】
1.一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增所述经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述经过转换的DNA片段；其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述一端能够锚定接头引物C的目的片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；3)高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10个核苷酸中C与G之和大于或等于7个，使其退火温度达到40度至60度之间；其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增；步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。2.根据权利要求1所述的方法，所述修饰剂为亚硫酸氢盐。3.根据权利要求1所述的方法，所述引物A的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含C、A和T；所述引物B的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述引物A的3’端第二个核苷酸为C。5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为中等CpG频率，其所述中等CpG频率是指引物3’端起前7个核苷酸中包含1个CpG。6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高C频率，其所述高C频率是指3’端起前5个核苷酸中至少包含3个C。7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高CpG频率，其所述高CpG频率是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG。8.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述引物B的3’端部分特征为极高CpG频率，其所述极高CpG频率是...

【专利技术属性】
技术研发人员：文路，李静宜，黄岩谊，汤富酬，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11