一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法技术

本发明专利技术公开了一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法，本发明专利技术通过对动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中KCC2基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中KCC2基因mRNA水平的变化。本发明专利技术使用的KCC2的探针序列，对KCC2基因的显示有明确的特异性，实现了对KCC2基因mRNA水平的显示作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其是。
技术介绍
氯离子是细胞内最重要阴离子。在神经系统，神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态，是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。一旦氯离子失去平衡，将直接导致神经系统疾病产生。目前已经发现，氯离子失衡可导致是包括帕金森病、癫痫、缺血缺氧、阿尔茨海默病、脑震荡、神经病理性痛、脊髓损伤、糖尿病性神经病、精神分裂症和小脑共济失调等多种神经系统疾病的重要因素。氯离子是由细胞膜上的氯离子转运体负责运入或者运出细胞。目前为止共克隆得到8个氯离子转运体蛋白分子:包括2个NKCC蛋白、4个KCC蛋白、I个NCC蛋白以及I个CIP蛋白。KCC2是神经系统内最重要的升高神经元内氯离子浓度的蛋白。KCC2全名为 钠离子钾离子浓度梯度驱动的氯离子内向转运体。KCC2的工作原理是:按1:1: 2的比例将I个钠离子和I个钾离子转运出胞体，而同时将2个氯离子转运入胞体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的是通过以下技术方案来解决的:一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac3J 。所述探针的设计方法，按照如下步骤:(I)根据KCC2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列；(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针；(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。所述步骤⑴中KCC2特异的引物是:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。所述步骤(2)按照如下步骤进行:(a)将小鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接;(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。所述步骤(3)按照如下步骤进行:(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的；(b)需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。所述步骤(4)按照如下步`骤进行:(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；(b)取材后进行脑组织的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存与DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用；(d)将切好的组织片用DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5分钟；(e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5分钟；(f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育I小时；(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；(h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；⑴用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C , I 次，每次 3O 分钟；(k)用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(I)用PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(m)按1:2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin -AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(η)将经过上步抗体孵育的组织片进行PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10分钟；(ο)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15分钟；(P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4飞小时，在此过程中观察切片呈色强度；(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10分钟；(r)将上述洗漆后切片表于载玻片上；(s)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。本专利技术的有益效果是:本专利技术对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中KCC2基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中KCC2基因mRNA水平的变化。本专利技术使用的KCC2的探针序列，对KCC2基因的显示有明确的特异性，实现了对KCC2基因mRNA水平的显示作用。附图说明图1-A为脑部切片的40倍放大特异效果图；图1-B为脑部切片的400倍放大特异效果图。具体实施例方式下面对本专利技术做进一步详细描述:KCC2基因cRNA原位杂交的探针的设计方法，按照如下步骤:(I)根据KCC 2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列；(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针；(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。探针的设计:根据KCC2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列。KCC2特异的引物如下:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。KCC2特异的探针序列:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为：5“tt?ccaggttatg?agtgtggtgt?caggcttcag?tcctcttatc?agtgctggga?ttttctctgccacactttcc?tctgccctgg?catctctcgt?cagtgcccca?aaagtgtttc?aggctttatgcaaagacaat?atctatcctg?gaattgcaat?ttttggaaag?ggctatggca?agaacaacgagcccctgcga?ggatattttc?ttacctttgg?cattgcgtta?gcttttattc?taattgcgga?gttgaacgtcattgccccaa?tcatttccaa?ctttttcctg?gcatcatacg?ctctcatcaa?cttctcggtg?tttcacgcttcgctggccaa?ttcccctgga?tggaggccaa?gcttcaagta?ctacaacatg?tgggcgtctctggccggggc?aatcctatgt?tgtgttgtca?tgtttatcat?caattggtgg?gcagcgcttttgaccaacgt?cattgtctta?tccctttaca?tctacgtcag?ctacaaaaaa?ccagatgtgaattggggttc?gtcaac?3“。...

【技术特征摘要】
1.一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为: 5’ 11 ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac 3’ 。2.如权利要求1所述探针的设计方法，其特征在于: (1)根据KCC2的Genebank序列设计KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列； (2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； (3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针； (4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(I)中KCC2特异的引物是:上游引物是 5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ； 下游引物是 5，GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行: (a)将小鼠的cDNA用KCC2特异的引物进行PCR扩增； (b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7、SP6启动子的载体进行连接； (d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行: (a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性内切酶对质粒进行酶切； (c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。6.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行: (a)将小鼠用0.4%戍巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉,用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.0lmol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雁灵，王亚云，魏燕燕，郭保霖，隋秉东，郑晨曦，李云庆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
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