本发明专利技术公开了一种Her‑2基因的cDNA原位杂交探针及其制备方法，属于分子病理诊断领域。所述探针的制备方法，包括：收集Her‑2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物为长度987bp的Her‑2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述Her‑2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒；将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针。本发明专利技术使用的Her‑2基因的cDNA原位杂交的探针序列，对Her‑2基因DNA的显示有明确的特异性，实现了对Her‑2基因DNA水平扩增情况的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子病理诊断领域，特别涉及一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针及 其制备方法。
技术介绍
人表皮生长因子受体-2 (Epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是表 皮生长因子受体EGFR家族的第二个成员，大约20%~30%的乳腺癌病例中存在Her-2基因 和/或HER-2蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌的靶向治疗和预后判断 中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。Her-2基因阳性肿瘤是一种高危肿瘤，Her-2 基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短，无病生存期（Disease free survival, DFS)和总生存期（Overall Survival, OS)缩短，对某些常规的化疗和激素 治疗反应性差。基于Her-2基因在乳腺癌诊断及治疗中重要的指导意义，使用标准的检测 手段和准确的判别标准检测乳腺癌样本中Her-2基因的扩增情况，对于评价预后、预测化 疗与内分泌治疗效果及是否选择赫赛汀治疗具有指导意义。 临床上常用免疫组织化学法（Immunohistochemistry, IHC)检测HER-2受体蛋白 在肿瘤细胞表面的过表达，该方法简便、费用低廉、对材料的要求不高，是初步筛查的首选 方法。 在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题： 在进行免疫组织化学法检测时，肿瘤细胞标本在固定和处理过程中，其HER-2受 体蛋白容易受到破坏，HER-2受体蛋白受到破坏后，抗原会对此进行修复，使得HER-2受体 蛋白的特异性会降低，进而降低了免疫组织化学法检测的准确性。
技术实现思路
为了解决现有技术只能够采用免疫组织化学法检测HER-2受体蛋白准确性低的 问题，本专利技术实施例提供了。所述技术 方案如下： -方面，本专利技术提供了一种Her-2基因的cDNA原位杂交探针，所述探针的序列如 序列表中SEQ ID NO. 1所示。 另一方面，本专利技术提供了一种制备上述的探针的方法，所述方法包括： 收集Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织，提取所述肿瘤组织的总 mRNA，将所述总mRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA与引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述 扩增产物为长度987bp的Her-2基因片段，即为所述探针的片段，构建含有所述Her-2基因 的cDNA原位杂交探针序列的质粒。将所述质粒作为模板，并利用所述引物和罗氏的聚合酶 链式反应地高辛探针合成试剂盒进行探针标记，得到所述探针；其中，所述引物包括： 上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 3 所示。 进一步地，所述构建含有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒的方 式为：将所述扩增产物进行电泳，得到凝胶产物，并在所述凝胶产物上切取所需目的产物条 带，并对所述目的产物条带进行回收，得到回收的所述扩增产物，再将所述回收的扩增产物 连接至PUM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5 α中，挑取阳性克隆，所述阳性克隆即为所述 含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。 具体地，所述扩增程序为： (1)95 ? 3 分钟； (2)%。〇3〇 秒； (3)58。〇3〇 秒； (4)72°C30 秒； (5)重复步骤（2)- (4) 30个循环； (6) 72°C 10 分钟。 具体地，所述扩增的反应液为：所述模板1μ 1，所述上游引物1μ 1，所述下游引 物 1μ 1，dNTPly l，10Xbuffer2. 5μ 1，MgCl22y 1，rTaq酶0· 5μ 1，蒸馏水 16μ 1，总体积 25 μ 1。 进一步地，所述电泳时采用浓度为1%的琼脂糖凝胶。 进一步地，所述方法还包括：在所述挑取阳性克隆后进行测序。 进一步地，采用RNA裂解液提取所述总mRNA。 进一步地，利用定量反转录试剂盒将所述总mRNA逆转录为cDNA。 本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术对乳腺癌患者肿瘤组织 进行取材、切片，通过罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒标记的探针与组织中 Her-2基因的DNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中Her-2基因 DNA水平 的变化，本专利技术使用的Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列，对Her-2基因 DNA的显示有 明确的特异性，实现了对Her-2基因 DNA水平扩增情况的检测。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一 步地详细描述。 实施例 1.弓丨物的设计 根据Her-2基因的Gene bank序列设计了 Her-2基因特异性的引物，引物序列 为：上游引物：5' -AGGAGTGCGTGGAGGAAT-3'，如序列表中SEQ ID NO. 2所示；下游引物： 5' -CCAGCCCGAAGTCTGTAAT-3'，如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示。 2.制备含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒 (1)收集60例Her-2基因高表达的乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织（60例患者来自武 汉市六医院，自2011年2月至2013年6月），利用RNA裂解液（Trizol法)提取该肿瘤组织的 总mRNA，将提取出的总mRNA利用定量反转录试剂盒（Quanti Tect Reverse Transcription Kit)逆转录为cDNA ; (2)将该CDNA用设计的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，该扩增产物为长度 987bp的Her-2基因片段，即为探针的片段； 其中，扩增的程序为： (1)95 ? 3 分钟； (2) 95? 30 秒； (3) 58? 30 秒； (4)72°C30 秒； (5)重复步骤（2)- (4) 30个循环； (6) 72°C 10 分钟。 扩增的反应液为： 所述模板1 μ 1，所述上游引物1 μ 1，所述下游引物1 μ 1，dNTPl μ 1， 10父1311打6^.5 4 1，]\%(：122 4 1，1^39酶0.5 4 1，蒸馏水16 4 1，总体积25 4 1。 (3)将该扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，参照DNA Marker切取位置在凝胶产物 上的987bp处的条带切取所需目的产物条带； (4)将切取的目的产物条带，用胶回收试剂盒进行回收，得到回收的扩增产物； (5)将该回收的扩增产物连接至pUM-T载体上，得到连接后的质粒； (6)将连接后的质粒转化到大肠杆菌DH5ci中，挑取阳性克隆，该阳性克隆即为含 有所述Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒。 (7)在挑取阳性克隆后进行测序。 3.标记Her-2基因的cDNA原位杂交探针 (1)测序正确后，经判断Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列插入载体的顺序是 正向的，该探针的序列如SEQ ID NO. 1所示； (2)少量培养阳性菌株，提取含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒； (3)以含有Her-2基因的cDNA原位杂交探针序列的质粒为模板，利用上述引物和 罗氏的聚合酶链式反应地高辛探针合成试剂盒（PCR DIG Probe本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Her‑2基因的cDNA原位杂交探针，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：茹琴，李超英，田香，乐凯，陈琳，马宝苗，熊琪，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。