【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其是一种NKCCl基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。
技术介绍
氯离子是细胞内最重要阴离子。在神经系统，神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态，是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。一旦氯离子失去平衡，将直接导致神经系统疾病产生。目前已经发现，氯离子失衡可导致是包括帕金森病、癫痫、缺血缺氧、阿尔茨海默病、脑震荡、神经病理性痛、脊髓损伤、糖尿病性神经病、精神分裂症和小脑共济失调等多种神经系统疾病的重要因素。氯离子是由细胞膜上的氯离子转运体负责运入或者运出细胞。目前为止共克隆得到8个氯离子转运体蛋白分子:包括2个NKCC蛋白、4个KCC蛋白、I个NCC蛋白以及I个CIP蛋白。NKCCl是神经系统内最重要的降低神经元内氯离子浓度的蛋白。NKCCl全名为钾浓度梯度驱动的氯离子外向转运体。NKCCl的工作原理是:按1:1的比例将I个钾离子转运入胞体，同时将I个氯离子转运出胞体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种NKCCl基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来解决的:一种NKCCl基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为:
【技术保护点】
一种NKCC1基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为：5“att?gtgggaattt?gtaatatcag?aagcaaaacg?gtttctcaca?cactgctgtt?ttgatagtgctgtagttgg?tttgacatcg?attctctcct?ttctcagtct?ctgtagactg?aagtggataa?cggatcgggtcatttgcctc?ttctcagagt?gttttcacta?ttgaaagtgt?ggtacagata?cattgcacgt?tgttctccacggccaggtag??tttagcagga??atctgtggtt??accccgaaga??tttagaaaga??ctttcacctggaggctgtaa?tgcgcctgga?acctacctag?atgcttccta?gggacatgtt?ttgtttctgt?tttaattcaaatctcagtaa?caaagcccta?caggttctca?aagctgtagg?ttttgttttt?ggtgtgcctg?ttcttggcatttttggtagt??gtccagaaaa??cag...
【技术特征摘要】
1.一种NKCCl基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为: ·5’ att gtgggaattt gtaatatcag aagcaaaacg gtttctcaca cactgctgttttgatagtgctgtagttgg tttgacatcg attctctcct ttctcagtct ctgtagactg aagtggataacggatcgggtcatttgcctc ttctcagagt gttttcacta ttgaaagtgt ggtacagata cattgcacgttgttctccacggccaggtag tttagcagga atctgtggtt accccgaaga tttagaaagactttcacctg gaggctgtaa tgcgcctgga acctacctag atgcttccta gggacatgtt ttgtttctgttttaattcaaatctcagtaa caaagcccta caggttctca aagctgtagg ttttgttttt ggtgtgcctgttcttggcatttttggtagt gtccagaaaa cagcacttgt gtggcagttg aaggagtgggcctgagccgcctgagctccc tgggaaggtt agaaagaagt gcgg 3’ 02.如权利要求1所述探针的设计方法，其特征在于: (1)根据NKCCl的Genebank序列设计NKCCl特异的引物，并且此对引物扩增出437bp的NKCCl片段作为NKCCl特异的探针序列； (2)构建NKCCI的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； (3)制备NKCCI的cRNA原位杂交探针； (4)检测NKCCl的cRNA探针的原位杂交。3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤⑴中NKCCl特异的引物是:上游引物是 5’GAC ACC CAC ACC AAC ACC TA 3’ ； 下游引物是 5’GTA CGC TCC TCC TCC TCT CA 3’。4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行: (a)将小鼠的cDNA用NKCCl特异的引物进行PCR扩增； (b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7、SP6启动子的载体进行连接； (d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行: (a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认NKCCI探针序列插入载体的顺序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性内切酶对质粒进行酶切； (c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。6.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行: (a)将小鼠用0.4%戍巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉,用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.0lmol/L DEPC-PBS是·2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0.1%的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚云，杨雁灵，魏燕燕，郭保霖，隋秉东，郑晨曦，李云庆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：
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