本发明专利技术属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种COⅢ及ND3基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了该扩增引物的设计和扩增方法。本发明专利技术可高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种高效扩增多种虾虎鱼类线粒体细胞色素 c (Cytc)氧化酶亚基III (cytochrome c oxidase subunit III ;C0 III)基因大部分序列及NADH还原酶复合体亚基3 (NADH dehydrogenase subunits 3 ;ND3)基因全序列的扩增引物及其设计和扩增方法。
技术介绍
鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(12SrRNA及16S rRNA)共37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。虾虎鱼类隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目，是世界上种类最多，分布最广的鱼类之一。估计全世界的虾虎鱼种类有2000多种，它们形成一个庞大的生物类群，在水环境尤其是海洋生态环境中占有重要的地位。虾虎鱼多为肉食性的小型鱼类，遍布全世界，尤以热带为多，主要为海水鱼类,大部分营底栖生活,主要特征是其腹鳍愈合成一吸盘状。近年来，由于过度捕捞、气候环境变化等原因，许多传统的经济鱼种资源已经形不成渔讯，有些甚至枯竭，但虾虎鱼类因其适应能力强、生命周期短、繁殖力强等原因，资源量却逐年增加。大部分虾虎鱼类经济价值不高，国内外有关于虾虎鱼类的研究相对较少，因其种类繁多，外部形态特征极为相似，导致不易鉴别和认定。目前，虾虎鱼类的分类还不甚清晰，很多种类的分类地位还比较混乱。 线粒体全基因组及线粒体基因组上的相关基因作为分子标记已被广泛地用于虾虎鱼群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域。CO III及ND3作为脊椎动物线粒体蛋白质编码基因中3个编码细胞色素c(Cytc)氧化酶亚基及7个编码NADH还原酶复合体亚基的基因之一，其所含的系统发育信息位于13个编码蛋白基因中的中上等，可应用于脊椎动物的系统进化和分类研究。然而未曾有报道过扩增线粒体CO III及ND3基因序列的通用引物，尤其是针对虾虎鱼类。因此设计特异性扩增虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因序列的通用引物，从而为高效获得虾虎鱼线粒体CO III及ND3基因序列及线粒体基因组全序列奠定基础。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的空缺，本专利技术旨在提供一对可高效特异扩增多种虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因序列的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因序列以进行系统进化和分类研究提供一个有力工具。本专利技术的目的还在于提供所述虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物的设计方法，以及利用所述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物对虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因进行扩增的方法。为实现本专利技术的专利技术目的，专利技术人提供如下技术方案: 虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。本专利技术的轻链引物Gobies-CO II1-ND3-F (SEQ ID N0.1所示)有21个碱基:ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于 0)111基因上；重链引物601^68-0)111-冊3-1 (SEQ ID N0.2所示)有 21 个碱基:GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于 tRNA_Arg 基因上。本专利技术所述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物对在东海海域采集的17种虾虎鱼类，均能获得片段长度为1150 bp左右的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及长度为720bp左右的CO III基因绝大部分序列的扩增产物，体现出本专利技术较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒CO III及ND3基因序列以进行系统进化及分类研究提供一个有力工具。作为优选，根据本专利技术所述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物，其中所述的虾虎鱼类包括但不限于下述:中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。·本专利技术还提供了上述虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物的设计方法，即登录NCBI网站中的GenBank数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索已测定的奸虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的COIII基因和tRNA-Arg基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出奸虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物。所用的Premier Primer5.0软件在生物软件网http://www.bio-soft, net/下载。本专利技术还提供了一种对虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因进行扩增的方法，其是采用上述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物对待测样品的DNA模板溶液进行PCR扩增。作为优选，根据本专利技术所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因进行扩增的方法，其中PCR扩增的条件为:95°C预变性5min，然后95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin20s，共35个循环，最后72°C延伸5min。作为优选，根据本专利技术所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因进行扩增的方法，其中PCR扩增的反应体系组成为:PCR反应体系为25μ ，内含dNTP (2.5mM) 2μ 、IOXTaq DNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的轻链引物和重链引物各 μ 、Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。作为优选，根据本专利技术所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因进行扩增的方法，其中所述的待测样品来自包括但不限于下述虾虎鱼类:中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点:本专利技术提供的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物，可以高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。同时本专利技术所述通用引物及其设计方法也可作为通用引物PCR扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本专利技术所涉及领域的前进发展，因而具备重要专利技术价值和理论意义。附图说明图1为本专利技术虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物用以扩增不同虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因序列的电泳图谱。其本文档来自技高网...
【技术保护点】
虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，其特征是由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.虾虎鱼类线粒体COIII及ND3基因扩增引物，其特征是由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体COIII及ND3基因扩增引物，其特征是所述的虾虎鱼类包括中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。3.—种如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物的设计方法，其特征是登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的CO III基因和tRNA-Arg基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出奸虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物。4.一种对虾虎鱼类线粒体COIII及ND3基因进行扩增的方法，其特征是采用如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体CO III及ND3基因扩增引物对待测...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐田军，王日昕，金逍逍，孙悦娜，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：
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