本发明专利技术公开了来源于水稻的ｍｉＲＮＡ－ｎ３及其应用。本发明专利技术保护的ｍｉＲＮＡ－ｎ３是序列表的序列１所示的ＲＮＡ。本发明专利技术保护的ｍｉＲＮＡ－ｎ３前体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－ｎ３）是序列表的序列２所示的ＲＮＡ。本发明专利技术还保护序列１所示ＲＮＡ在抑制ｂＨＬＨ转录因子基因表达和／或促进ｂＨＬＨ转录因子基因的ｍＲＮＡ降解中的应用。所述ｂＨＬＨ转录因子如序列表的序列３所示。应用ｍｉＲＮＡ－ｎ３有望获得在生长发育以及耐受逆境胁迫方面有重要表型的植株，具有重要的生物学意义和潜在应用价值，将为水稻的良种培育（如培育抗逆性水稻）提供宝贵的基因资源，具有重要的研究价值和潜在的社会效益，并最终用于生产实践。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及来源于水稻的miRNA-n3及其应用。
技术介绍
miRNA(microRNA,微小RNA)是一类长度约为20_24nt的内源单链非编码小分子 RNA，在生物体中广泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年来大量研究表明，miRNA能够调控生物体 中许多基因的表达，在调节生长发育、细胞增殖、凋亡、抵御环境胁迫等诸多方面发挥重要(Bushati N, Cohen S Μ. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ,2007,23 175-205.；金龙国，王川，刘进元.植物MicroRNA.中国生物化学与分子生物学报，2006， 22 =609-614.)。植物miRNA主要通过切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻译，来调控植物个 体生长发育并影响其生理过程，是一种新的基因调控模式，具有重要的研究意义(Voirmet 0. Origin, biogenesis, andactivity of plant microRNAs· Cell，2009，136 :669_687·)。水稻不仅是世界最重要的粮食作物之一，同时也是一种重要的模式生物，在植物 研究特别是单子叶植物研究中占有重要地位。目前已经发现了相当数目的水稻miRNA基 因，但发现的水稻miRNA基因数量还只是生物体内全部miRNA基因数的一部分，可能仍存 在着相当大一部分未被发现的miRNA，它们一般在结构或者序列上非保守，表达具有低丰 度、组织特异性或者诱导特异性的特点。这也提示我们在水稻某个特定生长时期、某些特定 组织、某种特殊胁迫处理条件下，通过最新的技术手段，仍然有望发现该条件特异表达的新 miRNA。而尽可能多地发现水稻中的miRNA，对于全面了解水稻乃至整个植物miRNA的形成 过程、结构特点和功能机制具有现实意义。我国是世界上人口最多的国家，同时也是主要的稻米生产和消费国，水稻对于我 国具有举足轻重的地位。国内外除了利用常规育种手段之外，逐步运用基因工程技术对水 稻品质(产量、抗虫、抗旱等)进行遗传改良已经成为了一种趋势。由于miRNA对植物有广 泛的调控作用，很可能成为植物遗传改良的重点研究基因之一，因此迫切需要通过大规模 测序方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA基因，从而为后期定向改良和培 育优质性状的水稻品种奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供来源于水稻的miRNA-n3及其应用。本专利技术保护的miRNA-n3的序列如下(5’ 一 3’)CUUCGGGGGAGGAGAGAAGC (序列表的序列 1)。本专利技术保护的miRNA-n3前体(pre-miRNA_n3)序列如下(5’ 一 3，)GGUUUUCUUGGAUCUCUCUCUCCCUUGAAGGCUAUCUCAUGGAG⑶UUGAUGUACACCAUU⑶UGCCUA AGAAACUGAGAAAGCCUUCGGGGGAGGAGAGAAGCCAAGCAAGCC。(序列表的序列 2)。本专利技术还保护序列1所示RNA在抑制bHLH转录因子基因(0s02g0178700)表达中的应用；所述bHLH转录因子如序列表的序列3所示。所述bHLH转录因子基因可如序列表 的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH转录因子基因也可如序列表的 序列4所示。本专利技术还保护序列1所示RNA在促进bHLH转录因子基因(0s02g0178700) WmRNA 降解中的应用；所述bHLH转录因子如序列表的序列3所示。所述bHLH转录因子基因可如 序列表的序列4自5’末端第79至711位核苷酸所示。所述bHLH转录因子基因也可如序 列表的序列4所示。序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA可用于水稻种质改良οSolexa克服了常规miRNA克隆技术的缺点，具有灵敏度高的优点，能够检测出最 少一个小RNA分子，并且准确性高，检出的小RNA分子碱基错误率极低。同时该技术还具有 高通量、大规模的特点，能够覆盖整个基因组，两个文库的测序量高达500万条小RNA序列 以上。基于这种最新的测序手段，将有望识别水稻中过去难以发现的低丰度或者某些条件 下特异表达的新miRNA。本专利技术采用国际上先进的Solexa高通量测序技术结合生物信息学分析、 Northern杂交、5’ RACE等多种生物学手段，首次从基因组水平鉴定到miRNA-n3，并且证实 miRn3的靶基因为bHLH转录因子基因，参与了植物发育过程的调控。过表达miRNA-n3的转 基因植株会有明显的发育方面的变化(根毛的长度、开花的时间等)，这都将为水稻的品质 育种(如培育抗逆性水稻)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终 用于实际生产。本专利技术提供的miRNA广泛参与了水稻多种生命活动的调节，具有重要的生 物学意义和潜在应用价值。附图说明图1为小RNA测序数据中分离和鉴定新miRNA的流程图。图2为0Sa-miRn3的前体二级结构图；黑线部分指示成熟miRNA所在的位置。图3为Northern杂交检测不同浓度H2O2处理的水稻幼苗中osa_miRn3的表达。图4为0Sa-miRn3的靶基因5’ RACE验证；序列上方的箭头表示发生切割的位点， 数值表示该切点处发生切割的克隆数与克隆总数比值。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中所用水稻品种均为籼稻品种93-11 (Oryza sativa L. ssp indica cv. 93-11)，水稻种子购自国家农作物种质保存中心(中国农业科学院作物科学研究所，邮 编100081联系电话010-68919715)。该水稻品种已经由中国北京基因组研究所完成基因 组测序工作。 实施例1、miRNA_n3的发现 一、H2O2 处理水稻种子经表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌发45h。萌发后将水稻转移 到光照培养箱中，培养箱条件设定为温度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照强度 400μ mol/m2 · s，相对湿度70%，由Hogland营养液提供水稻生长所需的全部营养，营养液 每2天更换一次。12天龄的水稻幼苗采用H2O2处理分别浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，将浸泡在蒸馏水中的水稻幼苗作为对照；各种处理的幼苗同时置于25°C摇床中处理 6h。处理完毕后，将各个处理的水稻样品按0. 5g分装，液氮速冻后保存于-80°C备用。二、miRNA_n3 的发现1、RNA 提取将水稻样品在液氮中研磨，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，操作步骤 按TRIZOL试剂盒自带的说明书进行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光本文档来自技高网...
【技术保护点】
序列表的序列１所示的ＲＮＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘进元，李甜，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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