本发明专利技术属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Chitinase及其dsRNA。本专利发明专利技术就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的序列如SEQ?ID?NO.1所示的灰飞虱致死基因片段Chitinase，利用该基因片段的dsRNA喂养灰飞虱，可使灰飞虱的校正死亡率可达65％以上，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物
，涉及基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段 Chitinase 及其 dsRNA。
技术介绍
在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差， 只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA (siRNA)，通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。因此，从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。本专利专利技术就是利用实验室改进的dsRNA喂食法从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种灰飞虱致死基因片段 Chitinase及其克隆方法。本专利技术的另一方法是提供该致死基因片段Chitinase的dsRNA及其合成方法。本专利技术的又一目的是提供一种用于筛选致死基因的dsRNA喂食法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现灰飞虱致死基因片段Chitinase，序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，包括如下步骤(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO. 2的上游引物Pl、序列为SEQ ID NO. 3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；(3) PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY_T3载体中，转化到大肠杆菌Tl，涂于含有x-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37°C培养，过夜；(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO. 1所示的Chitinase基因片段。其中，所述的RT-PCR扩增体系为反应缓冲液5μ L，Mg2+4y L，dNTP 4μ L，cDNA模板 2yL，上游引物 Pl lyL，下游引物 P2 1 μ L，R-Tag 酶 0. 5 μ L，ddH20 32. 5 μ L，共 50 μ L ； 所述的反应程序为941变性&^11，941 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，；35 个循环，72°C延伸。灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，序列如SEQ ID NO. 4所示。所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA 第一条链为模板，以序列为SEQ ID W). 5的上游引物P3、序列为SEQ ID NO. 6的下游引物 P4PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤(1)根据已经验证的Chitinase基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO. 5的引物3和序列为SEQ ID NO. 6的引物4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA，PCR体系为反应缓冲液5 μ L，Mg2+4 μ L，dNTP 4 μ L， cDNA 模板2μ L ；上游引物P3 2yL，下游引物 P4 2μ L,Ex Tap 酶 0. 25 μ L，ddH20 30. 75 μ L， 共 50 μ L ；PCR 条件为94°C变性 2min，94°C 30sec，55_62°C 30sec，72°C 30sec，38 个循环， 72°C延伸。Q)PCR产物经浓度为的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；(3)回收目标DNA产物。一种灰飞虱的dsRNA喂食方法，包含如下步骤(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜， 贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为^°C，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。所述的dsRNA优选所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的dsRNA。有益效果利用RNAi技术沉默Chitinase基因，对灰飞虱具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。本专利技术合成的Chitinase基因dsRNA能有效沉默Chitinase基因，更好地抵抗RNA 酶的降解，同时合成成本较低，便于大量实验使用。本专利技术采用改进的喂食法进行RNAi干扰实验，相对注射法，减少了虫体的机械损伤，更加便于实验操作。最终通过喂食实验验证了 Chitinase基因的RNAi对灰飞虱具有致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供新的实验手段。附图说明图 IdsRNA 合成电泳图，泳道 1 为 Marker，泳道 2 =Chitinase 的 dsRNA。图2两次独立重复试验校正死亡率比较。具体实施例方式实施例11. Chitinase基因片段的克隆方法(1)取灰飞虱10-20头，用TRIzoI法提取总RNA ；(2)合成cDNA第一条链；(3)从灰飞虱转录组中获取基因片段序列，在httD://www, ncbi. nlm. nih. gov/讲行同源性比对之后，预测为灰飞虱Chitinase基因，利用I^rimer premier 5. 0软件设计Pl 和P2，以RT-PCR方法进行扩增；上游引物(Pl)5' TCACCAACTCGCCCATTA 3' (SEQ ID NO. 2)，下游引物(P2)5' AGCCTCGTCACTCACCTTT 3' (SEQ ID NO. 3)；PCR 条件为94°C变性 2min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，35 个循环，72°C 延伸PCR 反应体系(50 μ L)权利要求1.灰飞虱致死基因片段Chitinase，其特征在于序列如SEQID NO. 1所示。2.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段Chitinase的克隆方法，其特征本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．灰飞虱致死基因片段Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，其特征在于序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李飞，李国清，董双林，韩召军，姜卫华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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