本发明专利技术涉及生物技术领域。造血干细胞移植是治愈恶性血液疾病的唯一途径，但是造血干细胞移植过程中的并发症仍是导致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病(GVHD)。如何防治GVHD是造血干细胞移植面临的严峻挑战。本发明专利技术提供一种携带可诱导性共刺激分子(ICOS)基因的腺病毒载体及其构建方法，本发明专利技术的腺病毒载体转染间充质干细胞(MSCs)后利用可诱导性共刺激分子在T淋巴细胞活化过程中的作用与间充质干细胞在免疫调节过程中的作用相结合的方法，达到防治GVHD的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及ー种携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体及其构建方法，以及该腺病毒载体在制备预防和治疗移植物抗宿主疾病中的应用。
技术介绍
基因治疗是指运用DNA转移来治疗或预防人类疾病，是在20世纪60年代随着多学科的发展而逐渐酝酿形成的。基因治疗最初是以治疗单基因遗传病为主，而今已广泛应用于肿瘤等疾病的治疗研究。基因治疗涉及目的基因、载体及受体細胞三方面。在基因治疗过程中，正常基因如何导入靶细胞是能否实现治疗目的的关键。基因治疗的途径有两类。ー类是in vivo途径，即直接体内途径，把带有目的基因的重组表达载体直接导入患者体内有关的器官组织或細胞内以达到治疗目的。这种途径简便，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌注、皮下包埋等，但在技术上还不太成熟，转染效率往往较低，还存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。另ー类是ex vivo途径，即先体外后体内途径，先在体外将目的基因导入载体細胞，然后再把转基因的载体細胞回输给患者，载体細胞在体内表达目的基因达到治疗目的。这种途径在技术上比较成熟、安全、易控制，但步骤少ヽ复杂ο基因转移的方法包括物理方法，如电穿孔法、基因枪法等；化学方法，如脂质体法、磷酸钙共沉淀法等；生物学方法，主要指应用病毒载体介导的基因转移，这是目前基因治疗中应用最多的基因转移方法。目前比较常用的病毒载体是经过改造的无害病毒，如逆转录病毒、腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等，它们转移DNA非常有效，可以通过其特定机制把目的基因转移到細胞中，但各种病毒载体均有其各自的优缺点腺病毒是呈二十面体対称的双链DNA (dsDNA)病毒。病毒颗粒具有252个壳粒，其中12个位于顶角的壳粒称五邻体，其余的称六邻体。每个顶角壳粒上有一条长度为10 30nm的纤维蛋白，纤维蛋白的抗原决定簇决定了病毒的种特异性和亚属特异性。腺病毒进入人体細胞进行复制，是以纤维蛋白的节区与細胞表面CAR相接触开始的。五邻体基底部含有5个Arg-Gly-Asp (RGD)序列，与細胞表面的α ν β 3禾Π α ν β 5整合素结合，介导腺病毒的内移。腺病毒的吸附和内化是两个不同的过程，需要五邻体的纤毛和基体分別与其相应的受体结合。腺病毒通过内吞小泡通路进入細胞的方法可以避免被溶酶体降解，随着内吞小泡中的PH值降低，纤毛从病毒外壳脱落，紧接着五邻体基部也从外壳解开，整个病毒外壳崩解，腺病毒的DNA从溶解的内吞小泡释放到宿主細胞的核中，这个过程需时约40分钟。腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一，其使用率仅次于逆转录病毒载体。腺病毒具有如下优势1、宿主范围宽广；2、转染效率高； 3、可插入外源基因片段大，外源基因表达稳定；4、制备滴度高(病毒滴度可达到1012 1013pfu/ml)，易于纯化；5、既可感染分裂期細胞又可感染分裂后細胞；6、不整合到宿主染色体，无插入突变。但其也有不足之处1、能引起宿主細胞免疫和体液免疫，使腺病毒及外源基因表达产物易被清除；2、不能充分感染某些具有临床重要性的细胞类型；3、不能专ー 杀伤靶細胞，特异性较低。目前应用的第一代腺病毒载体(Ad 5型)是用目的基因及其增强子/启动子序列插入其El区或E3区得到的复制缺陷型腺病毒载体，由含El基因的人胚肾細胞293包装成重组腺病毒。人腺病毒已发现51种血清型，分为A、B、C、D、E、F六个亚群，Ad5属于C亚群，这类以CAR为受体的腺病毒存在如下问题1、对靶細胞感染效率不高；2、在体内会引起严重毒副作用；3、人体内广泛存在5型腺病毒的中和抗体，导致病毒在体内很快被免疫系统清除；4、病毒对细胞的感染效率依赖于細胞表面CAR受体的表达水平，而造血系统細胞、 骨骼肌細胞、干細胞、树突状細胞、原代肿瘤細胞等重要細胞表面CAR表达量很低。这些问题限制了 Ad5的广泛应用。造血干細胞移植是治愈恶性血液疾病的重要途径，但是造血干細胞移植过程中的并发症仍是导致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病 (graft-versus-host disease GVHD)。如何防治GVHD是造血干细胞移植面临的严峻挑战。急性GVHD的病理过程主要分为三阶段移植预处理引起宿主组织的炎症反应；宿主抗原递呈细胞激活供体T淋巴細胞，引起相应的細胞因子分泌；这些細胞因子激活末期炎症介质(TNF-α、IL-1)，联合細胞毒性T細胞和NK細胞毒性杀伤作用，攻击肝脏、皮肤、胃肠道等移植GVHD靶器官，出现相应GVHD表现。因此，供体来源的T淋巴细胞是引起GVHD的直要因索(Appelbaum F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 2001 ；411 :385-389)。T細胞发挥效应，除了特异性抗原信号作用于T细胞受体外，还需要抗原提呈细胞(APC)提呈的共刺激信号激活，其中最主要的是OT^/CTLA4-B7、⑶40L-⑶40，但阻断这两个通路并不能避免移植排斥的发生。ICOS是T細胞上发现的可诱导性共刺激因子(Inducible Co-stimulator, I COS)，其结构与CD28相似、基因位点相近，其配体为 B7h(Jun li, Kenrick Semple, Woong-Kyung Suh, et al. Roles of CD 18, CTLA4 and Inducible Costimulator in Acute Graft-versus-disease in mice. Biol Blood Marrow Transplant. 2011 ；17 :962-969)。ICOS表达在激活的CD4+和CD8+T细胞表面，主要功能为增强回忆增殖反应，以及使刚激活的T细胞产生細胞因子，如IL-4、IL-5、IFN- y , TNF-α 等，起着介导T細胞效应的功能。因此如果阻断ICOS-B^1的信号传导途径，即可抑制移植物中的T細胞活化以及相关细胞因子的生成，减轻GVHD的发生(Nanji SA, Hancock WW, Luo B, et al. Costimulation blockade of both inducible costimu丄ator and CD40 ligand induces dominant tolerance to islet allografts and prevents spontaneous autoimmune diabetes in the NOD mouse. Diabetes. 2006 ；55 :27-33. Chen Y, Liu H, Liu L, et al. Blockade of inducible costimulator pathway to prevent acute rejection in rat liver transplantation. Am J Surg. 2009 ；198 :244—249)。目前尚未见有关携帯可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带可诱导性共刺激分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：王健民，杨丹，王利平，包晓辰，周虹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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