制造腺病毒和相应质粒的方法技术

本公开涉及制造包含一部分或全部的腺病毒基因组和一个或多个允许所述腺病毒基因组的快速和灵活操纵的原始限制性位点的腺病毒质粒的方法，和制备例如包含转基因的腺病毒构建体的方法。本公开还扩展至在所述方法中使用和由所述方法产生的新型中间体，所述方法的质粒和穿梭载体以及可从所述质粒和/或方法获得的腺病毒或腺病毒载体。本公开还涉及例如从本文公开的方法获得的病毒或载体在疗法中的用途，例如在癌症治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及制造包含一部分或全部的腺病毒基因组和一个或多个允许所述腺病毒基因组的快速和灵活操纵的原始限制性位点的腺病毒质粒的方法，和制备例如包含转基因的腺病毒构建体的方法。本公开还扩展至在所述方法中使用和由所述方法产生的新型中间体，所述方法的质粒和穿梭载体以及可从所述质粒和/或方法获得的腺病毒或腺病毒载体。本公开还涉及例如从本文公开的方法获得的病毒或载体在疗法中的用途，例如在癌症治疗中的用途。
技术介绍
出于许多原因希望将转基因插入腺病毒中，例如，使用有复制能力的病毒或复制缺陷型病毒载体来武装治疗性病毒以增加治疗效果或将基因递送至靶细胞。通常，为了将转基因插入病毒基因组中，产生包含腺病毒基因组的质粒，然后例如使用同源重组将所述转基因插入所述质粒中，然后从所述质粒切除病毒基因组。然而，出于本文中所述的原因，可以用于有复制能力的病毒和复制缺陷型病毒载体并且例如可以在已知和可预测的位置接受大的转基因的柔性质粒并不总是容易得到的，特别是如果所述转基因被插入不寻常的位置(例如E1或E3区外部)的话。与出于治疗和诊断目的将转基因插入腺病毒中相关的问题分为3个主要类别。首先，并非所有的腺病毒都是治疗和诊断应用的理想候选物，例如，Ad5(C亚群腺病毒)免疫性在人类群体中是普遍的并且因此所述病毒在其施用后被免疫系统迅速清除。为了克服这个问题，已经利用了存在较小普遍免疫性的腺病毒。然而，迄今为止大部分的基因组工作都是关于Ad5。因此，用于替代腺病毒的材料和资源往往不可用。其次，并非所有的腺病毒都可以接受大的转基因并且保持其作为活病毒的稳定性。此外，腺病毒基因组较大并且在不影响病毒功能的情况下插入额外遗传物质的空间很小，例如将病毒包装到病毒衣壳中的功能可能受到不利影响，这又可能影响病毒的感染性。为了克服这个问题，已经对基因组作出缺失。这种策略特别适合于复制缺陷型病毒载体，因为一个或多个复制所必需的基因被除去。这既限制了载体在体内复制的能力并且又在基因组中产生空间，从而允许插入大的转基因。这些转基因可以在体内表达，而与病毒载体不能复制无关。最频繁的是E1基因已经缺失。现有技术系统，例如ADEASY系统(Agilent Technologies)，允许将转基因插入E1区。在一些情况下，部分或全部的E3区缺失，参见例如WO2011/0123564，并且所述基因可被插入缺失区域中。因此，通常将转基因插入发生缺失的相同位置中。因此，转基因插入位点已经在很大程度上局限于早期基因的位置，这可能是有问题的，因为它更可能会影响病毒基因表达、病毒生命周期和/或复制速度。特别是，缺失E1区不适于有复制能力的腺病毒并且如所讨论的，它可能可用于插入转基因以使得它不在早期基因位置中以确保对病毒生命周期的影响被最小化。第三，腺病毒基因组不容易操纵，因为所述基因组是密集的并且具有很少的可在其中安全插入转基因而不影响病毒生命周期和/或功能(例如转录)的基因间物质。此外，在基因间区域中存在很少的(如果有的话)限制性位点并且甚至更少，即在基因组中仅出现一次。后者是相关的，因为当限制性位点在病毒基因组中出现一次以上时，则使用所述限制性位点在一个位置中选择性插入转基因的能力严重受阻。因此，希望提供可以用于操纵有复制能力的病毒并且其中转基因可被插入从早期基因除去的位置中的质粒。有复制能力的病毒可以利用的一种策略是使用非偏向性插入转座子以将转基因插入基因组中(如Jin等,2004中所述)。所述转座子可被插入晚期基因中并且因此这种技术不会具有上述系统的缺点。Jin等假设，基因插入位置的位点受到所插入基因类型影响，并且同时可在插入后置换一些基因，在一些情况下这难以置换所插入的基因或者将置换基因插入不同的定向。转座子插入的随机特性提供了许多可能的插入位点。因此，结果是可能会损害插入的可预测性和再现性。此外，所述转座子本身与转基因一起插入基因组中并且在理论上可在稍后日期“移动”所述基因在病毒基因组中的位置。然而，尽管随机插入转座子是用于研究病毒基因组的奇妙工具，但这种方法的最大缺点在于它不允许病毒构建体的合理设计。因此，希望提供可以用于操纵有复制能力的病毒并且其中转基因可重现地插入从早期基因除去的位置中的质粒。本专利技术人着手于通过产生具有限制性位点组合的质粒来克服一种或多种上述问题，所述限制性位点可用于选择性地将转基因特异性插入并非早期基因位点的位置中。本专利技术人已经开发了在L5基因附近包含原始限制性位点的腺病毒质粒。本公开的质粒允许产生在非早期基因位点的位置中具有限制性位点/转基因的病毒，例如对于E1区完整的有复制能力的腺病毒或者例如E1和/或E3缺失或中断的复制缺陷型腺病毒。
技术实现思路
在一个方面，提供制备包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因，所述方法包括如下步骤：a)制备包含连接相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：i)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂(包括所述5'ITR)，其中所述5'臂的5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的3'端终止于第三限制性酶位点，iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂(包括所述3'ITR和所述L5基因)，其中所述3'臂的5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的3'端终止于第一限制性酶位点，和进行一步三元连接以：在所述第一限制性酶位点将所述3'臂(片段iii)的3'端接合至所述载体片段(片段i)的5'端，在所述第二限制性酶位点将所述载体片段(片段i)的3'端接合至所述5'臂(片段ii)的5'端，和在所述第三限制性酶位点(至少L5基因)将所述5'臂(片段ii)的3'端接合至所述3'臂(片段iii)的5'端，以形成布置成如下的环化穿梭载体：第一限制性酶位点，接着是载体片段，接着是第二限制性酶位点，接着是5'臂，接着是第三限制性酶位点，接着是3'臂，b)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含(或由以下组成)E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。在一个实施方案中，所述方法包括另一个步骤c)：c)在步骤a)或步骤b)的穿梭载体与所述腺病毒基因组之间进行同源重组以形成质粒。在一个方面，提供制备包含腺病毒基因组、选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的腺病毒质粒的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因、E3位点和E4位点，所述方法包括如下步骤：a)制备包含连接相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：i)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂(包括所述5'ITR)，其中所述5'臂的5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的3'端终止于第三限制性酶位点，iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂(包括所述3'ITR和所述L5基因)，其中所述3'臂的5'端起始于第三限制性酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因，所述方法包括如下步骤：a)制备包含连接相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：i)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂(包括所述5'ITR)，其中所述5'臂的所述5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的所述3'端终止于第三限制性酶位点，iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂(包括所述3'ITR和所述L5基因)，其中所述3'臂的所述5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的所述3'端终止于第一限制性酶位点，和进行一步三元连接以：在所述第一限制性酶位点将所述3'臂(片段iii)的所述3'端接合至所述载体片段(片段i)的所述5'端，在所述第二限制性酶位点将所述载体片段(片段i)的所述3'端接合至所述5'臂(片段ii)的所述5'端，和在所述第三限制性酶位点(至少所述L5基因)将所述5'臂(片段ii)的所述3'端接合至所述3'臂(片段iii)的所述5'端，以形成布置成如下的环化穿梭载体：第一限制性酶位点，接着是载体片段，接着是第二限制性酶位点，接着是5'臂，接着是第三限制性酶位点，接着是3'臂，b)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含(或由以下组成)E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.24 EP PCT/EP2014/072919;2013.12.23 GB 13221.一种制备包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的穿梭载体的方法，所述腺病毒基因组包含5'ITR、3'ITR、L5基因，所述方法包括如下步骤：a)制备包含连接相等比例的以下三个片段的腺病毒穿梭载体：i)包含选择标记基因和低拷贝细菌复制起点的载体片段，其中所述载体片段的5'端起始于第一限制性酶位点并且在所述载体片段的3'端终止于第二限制性酶位点，ii)包含所述腺病毒基因组的5'端的5'臂(包括所述5'ITR)，其中所述5'臂的所述5'端起始于第二限制性酶位点并且在所述5'臂的所述3'端终止于第三限制性酶位点，iii)包含所述腺病毒基因组的3'端的3'臂(包括所述3'ITR和所述L5基因)，其中所述3'臂的所述5'端起始于第三限制性酶位点并且在所述3'臂的所述3'端终止于第一限制性酶位点，和进行一步三元连接以：在所述第一限制性酶位点将所述3'臂(片段iii)的所述3'端接合至所述载体片段(片段i)的所述5'端，在所述第二限制性酶位点将所述载体片段(片段i)的所述3'端接合至所述5'臂(片段ii)的所述5'端，和在所述第三限制性酶位点(至少所述L5基因)将所述5'臂(片段ii)的所述3'端接合至所述3'臂(片段iii)的所述5'端，以形成布置成如下的环化穿梭载体：第一限制性酶位点，接着是载体片段，接着是第二限制性酶位点，接着是5'臂，接着是第三限制性酶位点，接着是3'臂，b)将至少一个原始限制性位点和/或转基因引入所述穿梭载体中介于所述L5基因与选自包含(或由以下组成)E3位点、E4位点或所述位点两者的群组的位点之间的位置中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述5'臂包含约2.4至4.7kb的腺病毒基因组的5'端。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3'臂包含约3.3至4.8kb的腺病毒基因组的3'端。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3元连接是对于片段i)、ii)和iii)以1:1:1的比率进行的。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述一步三元连接进行至少50分钟。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述一步三元连接是在大约室温、例如20至25℃下进行的。7.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中所述原始限制性位点独立地选自FseI、NotI、SbfI和SgfI，例如NotI或SbfI和SgfI或FseI和NotI和SbfI和SgfI。8.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中所述第一限制性酶位点和第二限制性酶位点是相同的。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中所述载体片段是脱磷酸化的。10.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中所述复制起点是p15A。11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述选择标记基...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·C·N·布朗，T·尼科尔森，
申请(专利权)人：普西奥克瑟斯医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB