本发明专利技术一种质粒型腺病毒载体pAd-PPARGC1A及其构建方法，属于基因工程技术领域。构建方法是将秦川牛PPARGC1A基因插入pAdTrack-CMV穿梭质粒的CMV启动子之下，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-PPARGC1A。Pme?I线性化后转化含有pAdEasy-l腺病毒骨架质粒的E.coli?BJ5183感受态细菌，利用E.coli?BJ5183内源Cre重组酶的高效同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-PPARGC1A与pAdEasy-1的同源重组。将正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-PPARGC1A。pAd-PPARGC1A经Pac?I线性化后暴露反向的末端重复序列，脂质体转染HEK-293A细胞后产生重组病毒颗粒。本发明专利技术具有保证重组腺病毒载体的生物安全性、促进该基因的高效表达和利于后续检测该基因的表达的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种质粒型腺病毒载体PAd-PPARGClA及其构建方法，具体涉及一种含有黄牛PPARGC1A基因的质粒型腺病毒载体，该质粒型腺病毒载体的构建方法。
技术介绍
AdEasyTM系统是由T. C. He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需两步即可产生重组腺病毒先将表达盒装入穿梭载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是1)腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的限制性内切酶位点； 2)基因组过大(36kb)，难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个穿梭载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒骨架DNA质粒pAdEasy-Ι进行同源重组。pAdEasy-Ι缺失了 El和E3区，其El区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(invertedterminal repeats, ITR),转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的穿梭载体和完整的超螺旋腺病毒骨架质粒之间进行。应用完整的腺病毒骨架质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。穿梭载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的穿梭载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此该同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。重组子一经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5 α等进行扩增。由于缺乏recA活性,DH5 α不能用于腺病毒的同源重组。与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需I 3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5 α中扩增后转入哺乳动物细胞293Α，最后将293Α细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供El区功能的293Α细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需I小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。过氧化物酶体增殖激活受体Y共激活因子(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator I alpha,PGC-Iα 或PPARGCIA),编码基因为PPARGC1A，是转录共激活因子家族的一员，可以被冷刺激强烈诱导表达，刺激适应性产热以适应环境，在细胞能量代谢方面起重要作用。PGC-Ια参与多种代谢过程，包括线粒体的生物合成、葡萄糖的摄取、肝脏糖异生、脂肪酸β氧化、脂肪细胞分化、肌肉类型转换等。在人类医学研究中，PPARGC1A主要用来研究一些与代谢相关的疾病，如能量代谢障碍疾病、肥胖症、糖尿病等。在动物遗传育种研究中，由于PGC-Ia参与机体能量平衡和脂肪代谢调控的整个过程，PPARGC1A基因被作为影响动物生长、疾病发生和生物体内各种物质合成的侯选基因，研究动物的生长发育、肉类品质及产乳特性。目前未见在黄牛PPARGC1A基因功能方面的研究报道。通过构建秦川牛PPARGC1A基因腺病毒载体能够为黄牛肉质性能、生长性能的研究及新的优良品种(系)的育种提供重要的研究资料，最终为转基因动物的研究提供理论依据。
技术实现思路
为了解决上面所述的先有技术的缺点，本专利技术构建了能够表达秦川牛PPARGC1A基因的重组腺病毒载体，为黄牛PPARGC1A基因功能鉴定、改造细胞和调控代谢奠定了基础。本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA含有如SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的秦川牛PPARGC1A基因。上述技术方案中所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA是秦川牛PPARGC1A基因通过AdEasyTM系统构建所得。上述技术方案中所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA中PPARGC1A基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。 上述技术方案中所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA中PPARGC1A基因起始密码子前含有Kozak序列。上述技术方案中所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA中PPARGC1A基因终止密码子前含有6个His标签序列。构建上述技术方案中任一技术方案所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA的方法，所述方法包括如下步骤⑴、RT-PCR扩增PPARGClA后与pGM-T载体连接，转化E.coli DH5 α感受态细菌，得到pGM-T-PPARGC IA重组质粒；(2)、pGM-T-PPARGCIA重组质粒和pAdTrack_CMV穿梭质粒分别经限制性内切酶Sal I和Not I双酶切，将PPARGC1A基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E. coli DH5a感受态细菌，得到pAdTrack-CMV_PPARGC IA重组穿梭质粒；(3)、限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV-PPARGClA重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-PPARGCIA重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒E. coli BJ5183感受态细菌，利用E. coli BJ5183内源Cre重组酶的高效同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-PPARGCIA和pAdEasy-Ι的同源重组，获得同源重组成功的重组腺病毒质粒pAd-PPARGCIAο具体的RT-PCR扩增秦川牛PPARGC1A基因后与pGM-T载体连接，转化E. coli DH5 α感受态细菌。试剂盒抽提pGM-T-PPARGCIA重组质粒，限制性内切酶SalI和Not I酶切，酶切产物通过O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，O. 8%琼脂糖凝胶电泳结果与理论上图谱吻合。将质粒送交南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，PPARGC1A基因序列与NCBI数据库已公布的基因序列吻合。pGM-T-PPARGC IA重组质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒经Sal I和Not I双酶切，凝胶回收试剂盒回收PPARGC1A基因片段和pAdTrack-CMV载体片段，回收的载体片段和目的基因片段用T4DNA Ligase进行酶连反应。酶连产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种质粒型腺病毒载体pAd？PPARGC1A，其特征在于：所述质粒型腺病毒载体pAd？PPARGC1A含有如SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列的秦川牛PPARGC1A基因。
【技术特征摘要】
1.一种质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA含有如SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的秦川牛PPARGC1A基因。2.如权利要求I所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA是由秦川牛PPARGC1A基因通过AdEasyTM系统构建所得。3.如权利要求I所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA中的PPARGC1A基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。4.如权利要求I所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其特征在于所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA中的PPARGC1A基因起始密码子前含有Kozak序列。5.如权利要求I所述的质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA，其特征在于PPARGC1A基因终止密码子前含有6个His标签序列。6.构建权利要求I 5中任一权利要求所述质粒型腺病毒载体pAd-PPARGCIA的方法，所述方法包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，李密杰，刘栋，蓝贤勇，雷初朝，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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