用于治疗癌症的嵌合腺病毒制造技术

本发明专利技术为用于治疗癌症的嵌合腺病毒，涉及具有治疗用途的溶瘤腺病毒。本发明专利技术提供了重组嵌合腺病毒以及生产它们的方法。本发明专利技术的嵌合腺病毒包含衍生自B至F亚群分类的腺病毒血清型的核酸序列，并显示出提高的治疗指数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术通常涉及分子生物学领域，更具体地本专利技术涉及具有治疗应用的溶瘤腺病毒。
技术介绍
在美国和其它地区，癌症是死亡的主要原因。根据癌症的类型，典型地采用外科手术、化疗和/或放射进行治疗。这些治疗通常失败，显然需要有新的治疗手段进行单独使用或与传统技术结合使用。一种方法是使用腺病毒，单独使用或作为能够给肿瘤细胞输送抗-癌治疗蛋白的载体。腺病毒是无包膜二十面体双链DNA病毒，具有大约36千个碱基对的基因组。该病毒基因组的每一末端具有已知的反向末端重复(ITR)短序列，其实病毒复制所必需的。迄今为止检测到的所有人类腺病毒基因组具有相同的总体结构；即，编码特定功能的该基因定位于病毒基因组的相同位置。所述病毒基因组含有5个早期转录单位(E1A、E1B、E2、E3和E4)、2个延迟早期单位(IX和Iva2)和I个被加工产生5个家族的晚期mRNAs (L1-L5)的晚期单位(主要晚期)。由早期基因编码的蛋白质参与复制，而晚期基因编码病毒结构蛋白质。所述病毒基因组的一部分可以用外源DNA容易地进行取代，且重组腺病毒在结构上是稳定的，这些特性使得这些病毒对基因治疗具有潜在用途(参见Jolly，D. (1994)CancerGene Therapy 1:51-64)。目前，致力于产生临床上有用的腺病毒治疗的研究已聚焦于腺病毒血清型，Ad5。这一人类腺病毒的遗传学被很好地表征，对其进行分子操纵的系统也被充分地描述。大量生产方法已经被开发以支持临床应用，可获得一些关于该制剂的临床经验，参见，Jolly,D. (1994) Cancer Gene Therapy，1:51-64。涉及人类腺病毒(Ad)在癌症治疗中的应用的研究已聚焦于开发基于Ad5的腺病毒，该腺病毒在特定的肿瘤细胞类型中有更效价或者优先靶向特定的肿瘤细胞类型；且如果要想使得腺病毒治疗在临床上得到实际应用，则存在产生更有效的溶瘤病毒的需求。Ad5仅仅是51种目前已知的腺病毒血清型中的一种，基于不同的特性包括红血球凝聚特性其被分类为亚群A至F(参见，Shenk, ^Adenoviridae:The Viruses andTheir Replication,，，Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea. , Lippincott, Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001))。这些血清型在多个水平上不同，例如在人类和啮齿动物中的病理学、用于附着的细胞受体，但是这些区别在很大程度上被忽略了其可作为开发更有效的溶瘤腺病毒的潜在方法(除纤维蛋白改变(fiber alterations)夕卜，参见 Stevenson et al. (1997)J. Virol. 71:4782-4790;Krasnykh et al. (1996)J. Virol. 70:6839-6846 ；ffickham et al. (1997)J.Virol.71:8221-8229;Legrand etal. (2002)Curr. Gene Ther. 2:323-329 ；Barnett et al. (2002)Biochim. Biophys. Acta1-3:1-14;美国专利申请 2003/0017138)。对腺病毒血清型间的差异的利用可以为利用具有增强的选择性和效价的新的腺病毒的更有效的基于腺病毒的疗法提供来源。存在对这种改良的基于腺病毒的治疗的需求
技术实现思路
本专利技术提供了对基于病毒的治疗有用的新的嵌合腺病毒或其变体或衍生物。特别地，本专利技术提供了具有包含E2B区域的基因组的嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列； 其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此间不相同；以及，其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数。在一个实施方式中，所述嵌合腺病毒还包含编码纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的区域，其中编码所述蛋白的核酸均来自相同的腺病毒血清型。在另一个实施方式中，本专利技术的嵌合腺病毒包含经修饰的E3或E4区域。在另一个实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或造血肿瘤细胞中显示出提高的治疗指数。在一个特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞中显示出提高的治疗指数。在一个优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒的E2B区域包含SEQ ID N0:3。在一个特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒包含SEQ ID NO: I。本专利技术提供了具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同；其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数；以及其中所述嵌合腺病毒已通过缺失选自El、E2、E3或E4的一或多个编码参与腺病毒复制的蛋白质的腺病毒区域而成为复制缺陷型。在一个实施方式中，本专利技术的嵌合腺病毒还包含一种编码治疗性质蛋白质的异源基因，其中所述异源基因在被所述腺病毒感染的细胞中表达。在一个优选的实施方式中，所述治疗性蛋白质选自由细胞因子和趋化因子、抗体、前体药物转化酶和免疫调节蛋白质所组成的组。本专利技术提供了将本专利技术的嵌合腺病毒用于治疗目的的方法。在一个实施方式中，所述嵌合腺病毒可被用以抑制癌细胞的生长。在一个特定的实施方式中，包含SEQ ID NO: I的嵌合腺病毒被用于抑制结肠癌细胞的生长。在另一个实施方式中，本专利技术的嵌合腺病毒作为将治疗蛋白输送给细胞的载体是有用的。本专利技术提供了用于制备本专利技术的嵌合腺病毒的方法，其中该方法包括h)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；i)将来自步骤(a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传代；j)从步骤(b)收获上清；k)用在步骤(C)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物； I)在出现任何细胞病变(CPE)的迹象之前，从步骤(d)中收获细胞培养物上清；m)用在步骤(e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和η)通过空斑纯化从在步骤(f)中收获的上清中分离所述嵌合腺病毒。附图说明图I :Ad在TMAE HPLC柱上的保留时间图。A)用以产生原始的起始病毒池的各Ad血清型的保留图。B)分别衍生自HT-29、Panc-l、MDA-231和PC-3细胞系的20代传代池的保留图。图2 :各病毒池的细胞溶解活性。用各自的病毒池以VP/细胞比率为100-0. 01感染A) HT-29、B)MDA-231、C) Panc-I和D) PC-3细胞。根据不同的细胞系在感染后的不同天数(如图所标示)进行MTS检测。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/_标准差表示。每一图面描述了一个代表性的试验，且至少在3个独立的时间对全本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒的方法，所述E2B区域包含来自第一种腺病毒血清型的核酸序列和来自第二种腺病毒血清型的核酸序列；所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同，其中所述方法包括：a)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；b)将来自步骤(a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传代；c)从步骤(b)收获上清；d)用在步骤(c)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；e)在出现任何CPE的迹象之前，从步骤(d)中收获细胞培养物上清；f)用步骤(e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和g)通过空斑纯化从在步骤(f)中收获的上清中分离重组嵌合腺病毒。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·哈登，特丽·赫米斯顿，艾琳·库恩，
申请(专利权)人：普西奥克瑟斯医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：