本发明专利技术公开了猪肺炎支原体ｐ５２基因重组腺病毒及其构建方法和应用。本发明专利技术将ｐ５２基因克隆到穿梭载体ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ中经线性化后，电转化入ＢＪ５１８３菌内与其含有的骨架载体ｐＡｄＥａｓｙ－１同源重组，再与脂质体混合转染ＡＤ－２９３细胞，包装成完整的腺病毒。经ＲＴ－ＰＣＲ、间接免疫荧光鉴定后扩增病毒，收集病毒液，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，并分析了免疫效果。结果表明，成功构建了表达ｐ５２基因的重组腺病毒，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２９８６。该重组腺病毒可以正确表达目的蛋白，效价高。动物实验证明，本发明专利技术重组腺病毒可以产生特异性体液免疫和黏膜免疫应答反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组病毒，尤其涉及一种猪肺炎支原体p基因重组腺 病毒及其构建方法，本专利技术还涉及该重组腺病毒在预防或治疗猪肺炎支原体中 的应用，属于猪肺炎支原体的防制领域。
技术介绍
猪肺炎支原体(ilfycophsffla力yop刀e咖oin'ae, Mhp )是引起猪支气管肺炎 (Mycoplasmal pneumoniae of swine， Mps ),又称猪地方性流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumoniae, SEP)的主要病原 (ROSS R F. Zh'sease of Sw^e[M]. Iowa: Iowa State University Press, 1986: 469 ~ 483. )。 Mhp是猪 特有的一种接触性传染病， 一旦传入猪群，可连续发生，很难清除，而且广 泛存在于世界各国，严重危害着养猪事业的发展。Mhp结构简单，无细胞壁，仅有3种细胞器，即细胞膜、核糖体和原核细 胞核。Mhp主要通过膜蛋白吸附于猪呼吸道上皮细胞表面的纤毛顶端，影响纤 毛运动，并使纤毛顶端折断和脱落，导致纤毛功能丧失，引起猪出现喘气症 状。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染，使死 亡率大大提高，给养猪业造成巨大的经济损失。Mhp耐药抹的普遍增多，致使 抗生素治疗效果不佳，所以除了用抗生素和良好的动物管理程序，通过疫苗 来防治Mps也是必要的。目前所使用的疫苗中，国产弱毒疫苗能产生有效的 细胞免疫，保护率可达80y。左右，但该疫苗采用胸腔注射，注射难度大，不易 推广。而灭活疫苗虽然注射技术要求不高，应激反应较小，但由于纟rt激发有效的细胞免疫和黏膜免疫而使保护率大为降低(TAJ IMA M，YAGIHASHI T. Isolation of AfycopJas/na /]yo;H2eu/no;1iae with porcine respiratory epithelium as observed by electron microspy [J]. iflfe i鹏im， 1982, 37 ( 4 ): 1162-1169;辛九庆，王亮，李媛.猪支原体肺炎的研究进展[JL猪业 科学，2006， 34( 11 )， 19 ~ 22. XIN Jiu—qing， WANG Liang, LI Yuan. The research progression of Mycoplasmal pneumoniae of swine [J]. 5^ine Indiistry Scie腦,2006, 34 ( 11 ) ，19~22. (in Chinese) )。 Mhp的培养基成本高， 培养时间长，培养物滴度低(大多在1 07-1 08 PFU.mL-1),使生产成本高，基 因工程疫苗能有效的克服Mhp培养困难的问题，利用外援载体大量表达Mhp 的相关抗原，从而作为候选疫苗的方向之一，具有很好的前景。Geary等发现Mhp的致病因子位于细胞膜上，而不是细胞质中。Tracey等 研究表明P159蛋白是Mhp细胞膜表面的一种重要粘附素，其中P52蛋白是P159 蛋白C末端区域，在不同林的Mhp中序列比较保守，抗P52蛋白血清能减弱Mhp 对真核细胞的黏附能力，表明P52蛋白在P159蛋白黏附真核细胞中起重要作用 (MINION F C,LEFK0WITZ E J,MADSEN M L， et al. The genome sequence of AfycopJasflia /iyopiieii/no/n-ae strain 232， the agent of swine mycoplasmosis[J]. / 5acterio人2004, 186 ( 10 ) : 7123—7133; TRACEY A B， KATRIN D，MANFRED R, et al. P159 is a proteolytically processed, surface adhesin of Afycoj 2as鹏/2y0pne咖0uiae: defined domains of P159 bind heparin and promote adherence to eukaryote cells [J]. Mo2ecu_Zar Micro&io2ogy, 2006, 60 (3), 669-686.),因此p52基因可以作为研制Mhp新型 疫苗的候选基因。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力 的新的生物治疗剂，它可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。4目前已知在支原体表面存在P97, P102, P159三个与Mhp致病性相关的高 分子量膜蛋白。P97蛋白是最典型的黏附因子，经证实Mhp细胞粘附作用的缺 失与其P97的缺失相关，在其下游有一段与之相邻的基因P102,由于它与P97 相邻，人们预测它也有细胞勦附或辅助P97的细胞黏附作用。P159蛋白是Mhp 表面粘多 糖，不能在大肠杆菌中表达，通过蛋白组学发现P27、 PllO、 P52 三段蛋白是P159前体蛋白翻译后经蛋白酶水解而成，其中P52蛋白是其主要免 疫活性部分。电镜下观察Mhp能黏附于猪肾上皮细胞(PK15 cells)，而一定 量的肝磷脂或抗P52蛋白血清能明显减弱Mhp黏附PK15 cells的能力，因此对 P159 C末端区域蛋白功能研究有重要意义。腺病毒是重组病毒疫苗的有效载体之一，El/E3区缺失复制缺陷型腺病毒 载体系统在安全性、高效性和操作性上都有其独特的优势，故受到普遍重视。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种表达猪肺炎支原体p52基因的重组腺病毒；本专利技术的目的之二是提供一种构建上述重组腺病毒的方法；本专利技术的目的之三是将上述重组腺病毒应用于猪肺炎支原体的预防或治疗；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的猪肺炎支原体p基因重组腺病毒rAd-P52，其微生物保藏号是CGMCCNO. 2986;其分类命名是腺病毒；保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2009年3月26日；一种构建上述猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒的方法，包括以下步骤(1)将猪肺炎支原体p52基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中得到重组质粒pShuttle-CMV-P52; ( 2 )将重组质粒pShuttle-CMV-P52用P/neI线性化后，电转化入已含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的BJ5183细菌内，进行同源重组；筛选获得重组病毒DNA; ( 3 )提取重组病毒DNA，用Pac I酶切后与脂质体混合转染AD293细胞，培养，待细胞完全病变后反复冻融，收集上清，即得；本专利技术为了构建携带猪肺炎支原体(ilfycop!as鹏力yo卯eu迈o;]iae， Mhp )p52基因的重组腺病毒，首先从Mhp/林扩增p52基因，将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，经P迈eI线性化后，电转化入BJ5183菌内与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组，再与脂质体混合转染AD-293细胞，包装成完整的腺病毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪肺炎支原体ｐ５２基因重组腺病毒，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ ＮＯ．２９８６。
【技术特征摘要】
1、猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒，其微生物保藏号是CGMCC NO.2986。2、 权利要求1所述猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒的构建方法，包括以 下步骤(1)将猪肺炎支原体》2基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中得 到重组质粒pShuttle-CMV-P52; ( 2 )将重组质粒pShuttle-CMV-P52用P/ne I 线性化后，电转化入已含有腺病毒骨架载体pAdeasy-...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛九庆，李媛，曹培丽，陈超，郭丹，王亮，乔祖建，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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